Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
Изменение патогенности Klebsiella Pneumoniae при дисбиозе кишечника, вызванного бластоцистной инвазией
03.02.03 - Микробиология
кандидата медицинских наук
Бурганова Рамиля Фаритовна
Челябинск, 2011
Работа выполнена на кафедре общей и клинической фармакологии с курсом микробиологии Института медицины, экологии и физической культуры Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет
Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Потатуркина-Нестерова Наталия Иосифовна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Бурмистрова Александра Леонидовна
доктор медицинских наук, профессор Жестков Александр Викторович
Ведущая организация: ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова»
Защита диссертации состоится «____» июня 2011 года в___часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.03 при ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».
Автореферат разослан «____»_______________ 2011 года.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Л.С. Латюшина
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. В последние годы наблюдается значительный рост инфекционных заболеваний, этиологически ассоциированных с условно-патогенными микроорганизмами, среди которых одно из ведущих мест занимают бактерии рода Klebsiella (Леванова Л.А., 2001; Фиалкина С.В., 2004; Прозоркина Н.В., Рубашкина Л.А., 2005; Егорова С.А., 2007). Многие исследователи признают значительную роль этих бактерий в инфекционной патологии человека и особенно в развитии госпитальных инфекций вызывают 4,5-44,0% всех внутрибольничных острых кишечных инфекций, 8,7-56,9% - госпитальных пневмоний, 6,0-86,0% - бактериемий, 7,0-42,0% - инфекций мочевыводящей системы, 4,8-12,0% - инфицирование послеоперационных ран и ожоговых поверхностей. Спектр заболеваний, вызываемых клебсиеллами, чрезвычайно широк, они являются причиной заболеваний различной локализации. Их выявляют как при острых кишечных, так и при ряде парентеральных инфекций - урологических, менингиальных, токсикосептических и др. К частым проявлениям клебсиеллезной инфекции относятся внутригоспитальные заболевания, наблюдаемые среди детей раннего периода жизни в родовспомогательных учреждениях, больных в палатах интенсивной терапии, онкологических, геронтологических стационарах, ожоговых центрах (Тришин А.В. и соавт., 2005).
Клебсиеллезы характеризуются тяжелым течением и высокой летальностью, многообразием клинических проявлений. Однако концентрация клебсиелл в различном биологическом материале, полученном у больных и контактных, колеблется в значительных пределах, нередко клебсиеллы обнаруживаются в верхних дыхательных путях, в кишечнике и у здоровых людей.
Вероятно, этим обусловлено неоднозначное суждение об этиологической роли клебсиелл в развитии инфекционного заболевания. По данным некоторых авторов, у детей раннего возраста без клинических проявлений острого кишечного заболевания в значительном количестве выделяют различные энтеробактерии. Несмотря на проведение этиотропного лечения и применение пробиотиков, длительность их выделения может продолжаться несколько лет (Коршунов В.М., 2001; Леванова Л.А., 2002).
Поскольку эти микроорганизмы являются представителями факультативной микрофлоры толстого кишечника, обоснование их этиологической значимости при патологических состояниях даже при массивности выделения является сложной задачей и требует дальнейшего изучения факторов патогенности бактерий рода Klebsiella.
Показано, что условно-патогенные энтеробактерии, относящиеся к факультативной микрофлоре кишечника, обладают различными факторами патогенности (Бондаренко В.М., 1996; Мавзютов А.Р. и соавт., 2007; Жеребцов Н.Ю. и соавт., 2007). Однако информация о них до сих пор неполная, мало изученными являются генетические детерминанты факторов патогенности клебсиелл. Особую актуальность данная проблема приобретает в связи с высокой мобильностью этих нуклеотидных последовательностей, что позволяет им распространяться среди близкородственных бактерий. Именно интеграция, стабилизация и экспрессия генов вирулентности лежат в основе формирования новых свойств, в том числе патогенных.
В течение последних лет получены данные о значительном влиянии на микробиоценоз кишечника паразитарных инвазий (Торопова Н.П., Сафронова Н.А., Гордеева Л.М., 1998). Обнаружена роль паразитозов в развитии дисбиоза, сопровождающегося нарушением биоценотических взаимоотношений между патогенными бактериями и нормальной кишечной микрофлорой. В связи с этим, особую актуальность приобретает широко распространенная протозойная инвазия, обусловленная паразитированием в толстом кишечнике простейших Blastocystis hominis. Показано, что Blastocystis hominis способствуют реализации патогенного потенциала бактерий рода Proteus (Курзин А.В., 2008; Moe K.T. et al., 1998). Однако влияние бластоцист на свойства других энтеробактерий, в частности клебсиелл, до сих пор остается не изученным.
Цель исследования. Выявить факторы патогенности и их генетические детерминанты, а также чувствительность к антибактериальным препаратам у Klebsiella pneumoniae, выделенных при инвазии простейших Blastocystis hominis у гастроэнтерологических больных.
Задачи исследования:
1. Определить частоту встречаемости бластоцистной инвазии у гастроэнтерологических больных в зависимости от нозологической формы, стадии и продолжительности заболевания.
2. Оценить состояние микрофлоры толстого кишечника гастроэнтерологических больных при бластоцистной инвазии.
3. Провести сравнительное изучение факторов патогенности и чувствительности к антибактериальным препаратам клебсиелл, выделенных у гастроэнтерологических больных при наличии и отсутствии у них бластоцистной инвазии.
4. Дать сравнительную характеристику частоты встречаемости некоторых генетических детерминант патогенности клебсиелл, изолированных у гастроэнтерологических больных в условиях бластоцистной инвазии и без нее.
Научная новизна работы. Впервые обнаружено, что у гастроэнтерологических больных при бластоцистной инвазии среди условно-патогенных энтеробактерий доминируют бактерии рода Klebsiella.
Показано достоверное увеличение экспрессии в пуле штаммов клебсиелл, выделенных при бластоцистозе, генетических детерминант патогенности, обеспечивающих адгезию и токсинообразование (рар С, hly A, elt LT-1 и LT-2).
Впервые установлено, что уровень распространенности изученных ампликонов у штаммов Klebsiella pneumoniae после их сокультивирования с вирулентными бластоцистами достоверно увеличивался.
Дана характеристика особенностей микропейзажа кишечника гастроэнтерологических больных при бластоцистной инвазии. Показаны глубокие перестройки микробиоценоза кишечника, сопровождающиеся сменой ценотипа и иерархии групп микроорганизмов, которые зависели от периода (обострение, ремиссия) и продолжительности заболевания. Степень реализации патогенного потенциала клебсиелл усиливалась при их взаимодействии с бластоцистами.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Частота встречаемости простейших Blastocystis hominis у гастроэнтерологических больных значительно превышала этот показатель у здоровых людей (62,9% и 5,8% соответственно, р<0,05). Данное различие было наиболее выражено при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, хроническом гастрите и холецистите. Инвазированность больных бластоцистами нарастала в зависимости от продолжительности заболевания с 63,7% пациентов при стаже 1-5 лет до 87,4% обследованных при длительности заболевания свыше 10 лет. В период обострения заболевания, по сравнению с ремиссией, повышалась не только частота встречаемости B. hominis, но и их вирулентность, а также резистентность к антипротозойным препаратам.
2. Бластоцистная инвазия сопровождалась более выраженными дисбиотическими сдвигами микробиоценоза кишечника, чем при ее отсутствии. Эти изменения проявлялись сменой абсолютных доминант и увеличением видового разнообразия, характеризующиеся снижением уровня содержания облигатной микробиоты и увеличением представителей условно-патогенной группы. Выявленные нарушения микробиоты были характерны для всех больных в период обострения заболеваний и носили менее выраженный характер во время ремиссии.
3. Среди условно-патогенных энтеробактерий, выделенных у гастроэнтерологических больных при бластоцистной инвазии, Klebsiella spp. являлся доминирующим микроорганизмом. Достоверных различий фенотипических признаков патогенности клебсиелл, выделенных у пациентов с бластоцистной инвазией и без нее, выявлено не было, однако, обнаружено статистически подтвержденное увеличение в пуле исследуемых штаммов экспрессии некоторых генетических детерминант патогенности, усиливающейся при совместном культивировании вирулентных Blastocystis hominis. Кроме того, у клебсиелл, выделенных у больных без бластоцистной инвазии, после сокультивирования с простейшими происходило достоверное увеличение искомых ампликонов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Данные, полученные при оценке факторов патогенности бактерий рода Klebsiella, наряду с количественной характеристикой позволяют судить об их этиологической роли в возникновении дисбиотических состояний кишечника, сопровождающих заболевания пищеварительного тракта при бластоцистной инвазии. Выраженные дисбиотические сдвиги микрофлоры кишечника диктуют необходимость проведения регулярных исследований кишечного микропейзажа при данной патологии.
Высокая выявляемость бластоцист при заболеваниях желудочно-кишечного тракта диктует необходимость паразитологического обследования больных, особенно при тяжелом течении. Для выявления бластоцист рекомендуется применять, помимо микроскопического, культуральный метод, значительно повышающий эффективность диагностики.
Полученные результаты свидетельствуют о необходимости включения в программу обследования гастроэнтерологических больных проведения микробиологических и паразитологических исследований с целью прогнозирования течения заболевания для выявления дополнительных факторов, отягощающих течение основного заболевания.
Определение степени выраженности патогенных свойств и чувствительности к антимикробным препаратам отдельных представителей микробиоценоза кишечника в различные периоды гастроэнтерологических заболеваний позволяет использовать данные исследования для прогнозирования их течения, а также будет способствовать разработке наиболее оптимальной терапии данных заболеваний с учетом микроэкологических особенностей кишечника.
Получен патент на изобретение РФ № 2224465 от 27.02.2004. «Способ заражения экспериментальных животных бластоцистами».
Опубликованы практические рекомендации «Проблема клебсиеллезов в неинфекционной клинике» (г. Ульяновск, 1998) и «Микрофлора кишечника при бластоцистозной инвазии» (г. Ульяновск, 2003).
Результаты исследований используются в процессе преподавания на кафедрах биологии и биоэкологи, инфекционных и кожно-венерических болезней, курса микробиологии ГОУ ВПО «Ульяновский государственный университет». бластоцистный инвазия гастроэнтерологический кишечник
Апробация работы и публикации. Диссертация выполнена в соответствии с учебным планом научной работы ГОУ ВПО «Ульяновский государственный университет».
Результаты работы доложены на Региональной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы современного здравоохранения и экологии» (г. Ульяновск, 2003); XIII ежегодной научно-практической конференции студентов и аспирантов (г. Ульяновск, 2003, 2004, 2005); 11-й межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и соискателей (г. Пенза, 2004); 45-й научно-практической межрегиональной конференции врачей (г. Ульяновск, 2010).
По теме диссертации опубликовано 23 научные работы, из них 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, патент РФ на изобретение.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка использованных литературных источников. Список литературы включает 217 источников, в том числе 133 - отечественных автора и 84 - зарубежных. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 32 рисунками.
Содержание работы
Материалы и методы исследования. При выполнении работы клинические изоляты микроорганизмов получали в период 2007-2009 гг. у 243 больных, находящихся на лечении в ГУЗ Ульяновская областная клиническая больница (г. Ульяновск), с заболеваниями желудочно-кишечного тракта. Из всех обследованных больные язвенной болезнью желудка составили 54 (22,2%), язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки - 56 (23,0%), хроническим гастритом - 32 (13,2%), хроническим холециститом - 38 (15,6%), синдромом раздраженного кишечника - 32 (13,2%), неспецифическим язвенным колитом - 31 (12,8%) пациент. Группа сравнения включала 52 клинически здоровых человека, репрезентативных по полу и возрасту.
Программа исследования состояла из нескольких этапов: