2.4. Изменение профиля метилирования трех участков протяженного CpG-островка гена NKIRAS1 в эпителиальных опухолях.
Ген NKIRAS1 - NFKB inhibitor interacting Ras-like 1, или гомолог онкогена Ras, взаимодействующий с фактором некроза NF-kappaB. Его другие названия: KBRAS1 и kappaB-Ras 1. Белковый продукт гена функционирует как G-белки, связанные с GTP/GDP и проявляющие GTP-азную активность. Показано, что белок NKIRAS1 участвует в регуляции деградации IkappaB (Fenwick et al., 2000) и в комплексе с IkappaB подавляет активность NF-kappaB (Chen et al., 2004). Ген NKIRAS1 содержит протяженный CpG-островок (1800 п.н.), окружающий 1-ый нетранслируемый экзон (рис.7). В этом островке мы выбрали три фрагмента, доступные для анализа методом МЧРА. Метилирование каждого из трех фрагментов CpG-островка данного гена было исследовано в 26 случаях РМЖ и 30 случаях НМКРЛ. Структурная организация гена, рестрикционная карта и позиции праймеров, использованных в работе, показаны на рисунке 7.
Рисунок 7. Структурная организация гена NKIRAS1: Показаны экзоны гена, начало 1-го экзона (+1), положение CpG-островка и расположение участков узнавания двух метилчувствительных рестриктаз : HpaII (9 участков) и HhaI (11 участков) - в протяженном CpG-островке. Показаны также позиции праймеров, использованных при МЧРА, трех исследованных фрагментов: фрагмента №1 (F1 и R1, 423 п.н.), фрагмента №2 (F2 и R2, 522 п.н.) и фрагмента №3 (F3 и R3, 472 п.н.); (>) - прямой праймер; (<) - обратный праймер.
Метод МЧРА с использованием 2-х метилчувствительных рестриктаз - HpaII и HhaI позволил определить профиль метилированя 8 CpG-динуклеотидов в первом фрагменте, 7 во втором и 10-ти в третьем. А для более полной картины был определен уровень метилирования каждого из трех фрагментов гена NKIRAS1. Данные по частоте и уровню метилирования 3-х фрагментов представлены в таблице 4.
Таблица 4. Частота и уровень метилирования 3-х фрагментов CpG-островка гена NKIRAS1 в образцах ДНК РМЖ и НМКРЛ и в образцах ДНК гистологически нормальной ткани.
Согласно данным МЧРА наблюдается деметилирование каждого из фрагментов гена NKIRAS1, а т.к. данный ген имеет гомологию с онкогеном RAS и взаимодействует с фактором некроза опухолей NF-kappaB (Chen et al., 2004) можно предположить онкогенные функции данного гена при РМЖ и НМКРЛ. Причем, при РМЖ фрагменты 1 и 2 показывают достоверные различия с учетом уровня метилирования, в то время как при НМКРЛ наиболее дистальные фрагменты показывают статистически достоверные различия как частоты, так и уровня метилирования CpG-динуклеотидов этих фрагментов. Данные о метилировании гена NKIRAS1 получены впервые.
Следует также сказать, что в случае генов RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, GPX1 не было выявлено методами МС-ПЦР и МЧРА ни одного случая метилирования в лейкоцитах переферической крови от 15 здоровых доноров и в образцах тканей легкого, почки и молочной железы от 6 человек, онкологически здоровых в анамнезе. Напротив, метилирование было выявлено во всех образцах контролей в случае генов RHOA и NKIRAS1. В случае гена USP4 ситуация неоднозначная, т.к. было выявлено, что изменение метилирования этого гена обладает ткане-специфичным и опухоль-специфичным характером. Ген USP4 метилирован в ДНК лейкоцитов от 15 здоровых доноров. Представляет интерес выявление метилирования промоторных районов, данных генов в образцах ДНК из гистологически нормальной ткани онкологического пациента, что может указывать на возможность молекулярных изменений в эпителиальных тканях еще до появления морфологически выраженной патологии. Для ряда генов (RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, RHOA) в нашей лаборатории проведено исследование на наличие гомозиготных делеций в промоторных областях этих генов, гомозиготные делеции выявлены с частотой 5-10% (данные не представленны). Образцы с гомозиготными делециями были исключены из соответствующих выборок при исследовании метилирования.
3. Анализ корреляций между изменением метилирования CpG-островков генов RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, GPX1, USP4, RHOA и NKIRAS1 и клинико-гистологическими характеристиками исследованных опухолей ПКР, РМЖ и НМКРЛ.
Во второй части работы на основе полученных результатов проводили выявление возможных корреляций частоты и уровня метилирования промоторных CpG-островков представленных генов с клинико-гистологическими характеристиками опухолей, такими как стадия, степень анаплазии и размер опухоли, а также метастазирование в регионарные лимфатические узлы.
3.1. Связь метилирования промоторных CpG-островков генов RASSF1A и RAR-beta2 с прогрессией эпителиальных опухолей.
Для генов RASSF1A и RAR-beta2 исследована корреляция частоты метилирования промоторных CpG-островков с клинической стадией, степенью анаплазии, метастазированием в регионарные лимфатические узлы и размером опухолей почки, молочной железы и немелкоклеточного рака легкого; результат представлен на рисунке 8.
Рисунок 8. Корреляция частоты метилирования гена RAR-beta2 с прогрессией почечноклеточного рака (ПКР), уровня метилирования с прогрессией рака молочной железы; частоты метилирования гена RASSF1A с прогрессией рака молочной железы (РМЖ) Достоверность рассчитана с помощью теста Фишера.
Для гена RASSF1A связь между степенью метилирования и зависимостью от прогрессии наблюдали в нескольких видах рака: мочевого пузыря, головного мозга, предстательной железы, желудка и носоглотки, хотя всего анализировали более 20 видов опухолей (Dammann et.al., 2005; Fendri et al., 2009). Нами была устанавленна достоверная корреляция увеличения частоты метилирования промоторного района гена RASSF1A с увеличением стадии и степени анаплазии опухоли молочной железы, что согласуется с данными других авторов, установивших связь степени метилирования гена RASSF1A с плохим уровнем выживания пациентов при раке молочной железы (Karray-Chouayekh et al., 2009). Все это позволяет рассматривать ген RASSF1A как молекулярный маркер неблагоприятного прогноза РМЖ. В случае гена RAR-beta2 нами была выявлена зависимость частоты метилирования с прогрессией почечноклеточного рака и рака молочной железы, позволяющая включить ген RAR-beta2 в панель эпигенетических онкомаркеров для прогноза течения заболевания ПКР и РМЖ.
3.2. Связь метилирования 2-х CpG-островков гена SEMA3B с прогрессией эпителиальных опухолей.
Рисунок 9. Корреляция частоты метилирования 2-х CpG-островков гена SEMA3B с прогрессией рака молочной железы (РМЖ), почечноклеточного рака (ПКР) и рака легкого (НМКРЛ). Достоверность рассчитана с помощью теста Фишера.
Для гена SEMA3B показано частое снижение уровня мРНК в опухолях за счет эпигенетического метилирования проксимального интронного CpG-островка гена (Angeloni et al., 2007; Hesson et al., 2007). Нами были исследованы корреляции частоты метилирования интронного и промоторного CpG-островков с прогрессией РМЖ, ПКР и НМКРЛ (рис.9). Установлено, что метилирование промоторного CpG-островка связано с развитием всех 3-х эпителиальных опухолей. С другой стороны, выявлены статистически достоверные корреляции частоты метилирования интронного CpG-островка с размером опухоли при раке молочной железы и прогрессией рака легкого (рис.9). Таким образом, метилирование дистального CpG-островка промоторной области гена SEMA3B может служить онкомаркером как для ранней диагностики опухолей, так и для прогноза и мониторинга течения ПКР, РМЖ и НМКРЛ, в то время как метилирование проксимального CpG-островка может являться маркером неблагоприятного прогноза только для НМКРЛ.
3.3. Связь метилирования CpG-островков генов RHOA, USP4 и GPX1 с прогрессией эпителиальных опухолей.
При анализе профиля метилирования генов RHOA и USP4 было выявлено деметилирование их промоторных районов при НМКРЛ, что указывает на онкогенный потенциал данных генов при этом виде рака. Выявленные корреляции уровня метилирования промоторных CpG-островков генов RHOA и USP4 с клинической стадией и степенью анаплазии немелкоклеточного рака легкого подтвердили онкогенный потенциал данных генов при НМКРЛ (рис. 10).
Рисунок 10. Корреляция уровня метилирования промоторных CpG-островков генов RHOA и USP4 с прогрессией рака легкого (НМКРЛ). Достоверность рассчитана с помощью теста Фишера.
В одной из работ показано повышение уровня мРНК USP4 в опухолях МКРЛ и аденокарциномах легкого, а также онкогенная трансфор-мация клеток NIH3T3 при введении кДНК этого гена (Gray et al., 1995). Полученные нами данные по связи изменения метилирова-ния генов USP4 и RHOA согласуются с данными литературы об онкогенных функциях этих генов в опухолевой клетке, а связь изменения метилирования промоторных районов данных генов с прогрессией НМКРЛ, позволяют включить их в панель эпигенетических онкомаркеров для прогноза течения заболевания НМКРЛ. В случае гена GPX1 связи изменения метилирования с прогрессией опухолей, обнаружено не было.
3.4. Связь метилирования 3-х фрагментов CpG-островка гена NKIRAS1 с прогрессией эпителиальных опухолей.
Исходя из наших данных все три фрагмента CpG-островка гена NKIRAS1 деметилируются в опухолях молочной железы и немелкоклеточного рака легкого. Однако в случае РМЖ статистически достоверных корреляций частоты метилирования фрагментов CpG-островка с прогрессией данного вида опухоли не было обнаружено ни для одного из фрагментов.
В то время как для НМКРЛ такие корреляции были выявлены для первого и второго фрагментов (рис. 11). Для первого фрагмента установлена статистически маргинально-значимая корреляция уменьшения уровня метилирования с увеличением степени анаплазии. Для третьего фрагмента выявлена корреляция уменьшения уровня метилирования с клинической стадией, степенью анаплазии и размером опухоли, а также выявлено достоверное уменьшение метилирования третьего фрагмента с увеличением метастазирования в регионарные лимфатические узлы (рис.11), что позволяет использовать данный тест для диагностики и прогноза этого социально-опасного вида рака. Данные литературы по метилированию промоторной области данного гена отсутствуют.
Рисунок 11. Корреляция уровня метилирования 2-х фрагментов CpG-островка гена NKIRAS1 с прогрессией рака легкого (НМКРЛ). Достоверность рассчитана с помощью теста Фишера.
4. Предпосылки для разработки новых диагностических и прогностических онкомаркеров.
Одной из важных задач молекулярной медицины и практической онкологии является подбор системы из нескольких маркеров, оптимальных для диагностики и прогнозирования социально-опасных форм рака. К таким заболеваниям относятся рак легкого, который отличает высокая частота смертности, широко-распространенный рак молочной железы и почечно-клеточный рак, который часто не подлежит операбельному вмешательству. На основании полученных данных были выбраны гены наиболее полезные для диагностики, а именно, изменяющие статус метилирования при данном виде рака преимущественно в одну сторону, например, появление гиперметилирования, что характерно для генов-супрессоров, или наоборот, снятие метилирования (деметилирование), что характерно для онкогенов.
При ПКР применение 4-х генов-маркеров GPX1, RASSF1A, SEMA3B и RAR-beta2 позволяет выявить метилирование хотя бы одного из этих маркеров в 13 из 19 случаев (рис. 12). Таким образом, можно говорить, что панель этих маркеров позволяет выявить опухоль в 68% случаев ПКР.
Рисунок 12. Схематическое изображение метилирования 4-х маркеров в 19 образцах ПКР. Черный кружок - CpG-динуклеотиды промоторной области гена метилированы в образце опухоли и не метилированны в соответствующей гистологически-нормальной ткани. Во всех остальных случаях не выявлено изменения статуса метилирования. Сверху показаны номера образцов, исследованных на изменение метилирования промоторных районов всех представленных слева генов. Для гена SEMA3B приведены данные для 2-х CpG-островков. Снизу показаны основные клинико-гистологические характеристики: стадия и степень анаплазии опухоли.
При РМЖ для 4-х генов получены репрезентативные данные для общей выборки из 45 образцов. Метилирование хотя бы в одном из этих 4-х маркеров (RASSF1А, SEMA3B, RAR-beta2 и USP4) выявлено в 36 из 45 случаев (рис.13), то есть этот набор маркеров позволяет выявить опухоль молочной железы в 80% случаев.
Рисунок 13. Схематическое изображение метилирования 4-х маркеров в 45 образцах РМЖ. Основные обозначения как на рисунке 12.
Анализ 5-ти генов при НМКРЛ: выявление гиперметилирования генов-супрессоров RASSF1A, SEMA3B и деметилирование предполагаемых потенциальных онкогенов RHOA, USP4 и NKIRAS1 в общей выборке образцов показал, что аномальное метилирование хотя бы одного из этих 5-ти маркеров выявляется в 25 из 29 случаев (рис. 14) т.е. в 89% случаев НМКРЛ. Таким образом, выбрана система маркеров (рис. 14) для диагностики НМКРЛ с частотой выявления 89%.