Автореферат: Изменение метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3 человека в эпителиальных опухолях

Рисунок 3. А. Применение бисульфитного секвенирования и МЧРА при анализе метилирования CpG-островка промоторной области гена RAR-beta2. Сверху даны позиции CpG-динуклеотидов; CpG- динуклеотиды 4, 5, 6, 11, 14 и 15, исследованные двумя методами, отмечены белым шрифтом на сером фоне; с левого края приведены номера образцов ПКР. Черный прямоугольник указывает на выявление метилирования, белый прямоугольник - метилирование не выявлено. Приведены данные анализа для 9-ти образцов ДНК первичных опухолей ПКР (t) и образцов ДНК условно-нормальной ткани почки от 4-х пациентов (n). Б. Применение метода МС-ПЦР при анализе метилирования CpG-островка гена RASSF1A. Справа показаны клинико-гистологические характеристики опухоли: стадия и степень анаплазии опухоли.

Метод МС-ПЦР позволяет тестировать только 6 CpG-динуклеотидов в промоторной области гена RASSF1A, входящих в состав праймеров (M/U-L, M/U-R) (рис.1а). Для гена RAR-beta2 метод МЧРА позволил тестировать 8 CpG-динуклеотидов (рис.1б) в промоторном районе. Данные, полученные методом МЧРА, были подтверждены с помощью бисульфитного секвенирования. На рисунке 4 приведены примеры бисульфитного секвенирования этого фрагмента. Показан участок в 40 п.н., перекрывающий 6 CpG-динуклеотидов. Соответствие результатов бисульфитного секвенирования и МЧРА оценивали с использованием ранговой корреляции Спирмана. Результаты этих методов совпали в 44 из 78 CpG (22 с метилированием и 22 без метилирования). Корреляция результатов, полученных двумя независимыми методами для образцов ПКР, высоко достоверна: Rs=0.98, t=15,8, н=11, Р=6.52х10^-9.

Рисунок 4. Примеры бисульфитного секвенирования фрагмента гена RAR-beta2 (280 п.н.). Показан участок в 40 п.н. СрG-динуклеотиды подчеркнуты и пронумерованы в соответствии с рис 1б. (А) Исходный фрагмент до обработки бисульфитом (образец ПКР 500). (Б) Модифицированный неметилированный фрагмент (образец ПКР 703): все остатки цитозинов дезаменированы и превращены в тимин. (В) Модифицированный метилированный фрагмент (образец ПКР 500): цитозин в СрG-динуклеотидах остался не измененным, остальные остатки цитозина конвертированы в тимин.

Данные по частоте метилирования промоторных районов генов RASSF1A и RAR-beta2 представленны в таблице 1.

Таблица 1. Частота метилирования промоторных районов генов RASSF1A и RAR-beta2 в образцах ДНК ПКР, РМЖ и НМКРЛ и в образцах ДНК гистологически нормальной ткани.

*Под частотой метилирования подразумевали долю образцов, в которых данный ген метилирован.

Итак, в данной работе впервые показана высокая частота метилирования промоторного района гена RAR-beta2 при ПКР, данные по частоте метилирования при РМЖ и НМКРЛ согласуется с данными литературы (Karray-Chouayekh et al., 2009; Onay. et al., 2009; De Jong et al., 2009). Результаты данной работы подтверждают высокую частоту метилирования промоторного района гена RASSF1A в этих эпителиальных опухолях и весьма близки с данными других авторов (Dammann et al., 2005; Karray-Chouayekh S. et al., 2009). В ДНК из крови 15-ти здоровых доноров, а также 6 человек, онкологически здоровых в анамнезе, не выявлено ни одного случая метилирования CpG-островка гена RASSF1A и RAR-beta2.

2.2. Изменение профилей метилирования 2-х CpG-островков гена SEMA3B в эпителиальных опухолях.

Ген SEMA3B локализован в области 3р21.31. Он состоит из 18-ти экзонов, (9533 п.н., NCBI, Build 36), кодирует мРНК длинной 3.4 т.н. и белок 750 а.е. (Lerman&Minna, 2000). Функции гена SEMA3B разнообразны и связаны с онкогенезом. Ген SEMA3B может подавлять рост клеточной линии рака легкого NCI-H1299 и образование опухолей в мышах с иммунодефицитом (Tomizawa et al., 2001; Tse et al., 2002). Белок SEMA3B способен ингибировать активацию онкобелков MET и RON, индуцировать апоптоз и подавлять неоангиогенез в опухолях (Киселев и др., 2005). Во многих линиях клеток мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легкого выявлено метилирование CpG-островка в 5'области гена (Tomizawa et al., 2001; Kuroki et al., 2003; Ito et al., 2005), которая, как выяснилось позднее, соответствовала области первого интрона гена (NCBI, Build 36). Мы обнаружили локализованный в промоторной области протяженный CpG-островок (дистальный)(рис.5) с более высокой плотностью CpG-динуклеотидов (22 CpG/772 п.н.) по сравнению с проксимальным (8 CpG/400 п.н.), способный к связыванию ряда факторов транскрипции, содержащих участки взаимодействия с CpG-динуклеотидами (NCBI Build 36). В связи с этим представлялось целесообразным изучить и сравнить частоту метилирования двух CpG-островков в различных видах рака.

На рисунке 5 показана структурная организация гена SEMA3B, включая расположение промоторного (1-го) и интронного (2-го) CpG-островков.

Рисунок 5. Структурная организация гена SEMA3B. Показаны 2 CpG-островка: проксимальный (2-й CpG-островок) - в области интрона между нетранслируемым экзоном 1 и транслируемым экзоном 2 (перед ATG1, по Tomizawa et al., 2001), и дистальный (1-й CpG-островок) - в промоторной области гена (перед ATG2 по базе данных NCBI, версия 36). 1-й CpG-островок содержит 22 CpG-динуклеотида на участке 772 п.н., а 2-й CpG-островок - восемь CpG на участке 400 п.н.

В данной работе исследованно 83 парных (T/N) образца почечноклеточного рака, 61 образцец рака молочной железы и 38 образцов немелкоклеточного рака легкого. Методом МС-ПЦР определяли статус метилирования 6-ти CpG-динуклеотидов в дистальном CpG-островке и 3-х CpG-динуклеотидов - в интронном. Данные по частотам метилирования обоих CpG-островков представлены в таблице 2.

Таблица 2. Частота метилирования 2-х CpG-островков гена SEMA3B в опухолях почки (ПКР), молочной железы (РМЖ) и немелкоклеточного рака легкого (НМКРЛ).

В данной работе впервые проведено сравнение частоты метилирования промоторного и интронного CpG-островков гена SEMA3B в опухолях почки, молочной железы и немелкоклеточного рака легкого, показано, что частота метилирования промоторного островка выше в 1,5 раза во всех из представленных видов опухолей. Кроме того, получены данные для ПКР о понижении содержания мРНК гена SEMA3B при появлении метилирования в промоторном CpG-островке (Пронина и др., 2009), что позволяет предположить роль промоторного CpG-островка в инактивации гена-супрессора SEMA3B при почечноклеточном раке. По данным литературы метилирование интронного CpG-островка наблюдали ранее при раке легкого (Tomizawa et al., 2001; Kuroki et al., 2003; Ito et al., 2005), а также при нейробластоме, раке печени и желчного пузыря (Tischoff et al., 2005; Nair et al., 2007; Riquelme et al., 2007). Однако не было сообщений о метилировании промоторного CpG-островка этого гена в каких-либо видах эпителиальных опухолей.

2.3. Изменение профилей метилирования промоторных областей генов RHOA/ARHA, USP4 и GPX1 в эпителиальных опухолях.

Нами проведен предварительный анализ уровней мРНК ~30 генов из открытого нами нового «критичного» района между маркерами D3S2409 и D3S3667 (3p21.31, 600 т.п.н., Логинов и др., 2008) в эпителиальных опухолях. Использована информация, представленная в базах данных SAGE (серийный анализ экспрессии генов). В эпителиальных опухолях выявлены изменения уровня мРНК более 10-ти генов. Среди этих генов были отобраны три близко расположенных гена (RHOA/ARHA, USP4 и GPX1), которые согласно данным литературы, связаны с важными функциями клетки и предположительно участвуют в процессах онкогенеза.

Ген RHOA кодирует белок суперсемейства Ras-гомологичных малых гуанозинтрифосфатаз (Sahai and Marshall, 2002). Играет роль в адгезии, в регуляции клеточного цикла и апоптоза, а также в сигнальных путях клетки (Vial et al., 2003; Liu et al., 2004). Вызывает онкогенную трансформацию клеток in vitro и in vivo; усиливает инвазию опухолей (Kamai et al., 2003, 2004).

Ген USP4 кодирует убиквитин-специфическую протеазу 4-го типа (Unp), которая отщепляя убиквитин (76 а.о.), может на время останавливать процесс протеолитической деградации в протеасомах коротко-живущих белков, в том числе, регуляторных белков и компонентов сигнальных путей клетки, включая циклины A, B, E, p27, р53 и pRb, транскрипционные факторы E2F, NF-кB, протоонкогены c-myc, c-jun, c-fos, а также Ser/Thr-киназа c-mos (DeSalle et al., 2001). Ген USP4 на 90% идентичен мышиному протоокогену Unp, кодирующему ядерную убиквитин-специфическую протеазу, увеличение экспрессии которой приводит к онкогенной трансформации NIH3T3 клеток (Gupta et al., 1994). В одной из работ показано повышение уровня мРНК USP4 в опухолях легкого, а также онкогенная трансформация клеток NIH3T3 при введении кДНК этого гена (Gray et al., 1995). В другой работе, напротив, обнаружено снижение уровня Unp-белка в клеточных линиях МКРЛ и наличие двух изоформ в клеточных лизатах: 105 и 110 кД (Frederick et al., 1998).

Продукт гена GPX1 (glutathione peroxidase 1) восстанавливает перекись водорода и ее производные и представляет наиболее распространенный член семейства глутатионпероксидаз. Этот белок локализован в митохондриях, ядре и цитоплазме (Diwadkar-Navsariwala and Diamond, 2004). Как антиоксидантный селенопротеин он играет центральную роль в защите клеток от окислительного стресса и разрушения. Выявлено снижение белкового продукта гена GPX1 в злокачественных опухолях легкого (плоскоклеточный рак и аденокарцинома, Korotkina et al., 2002) и снижение мРНК в опухолях щитовидной железы (Hasegawa et al., 2002), а также способность подавлять рост эндотелиальной линии клеток ECV304 (Faucher et al., 2003). Показана связь определенных полиморфных аллелей гена с развитием разных форм рака, например, рака молочной железы (Hu et al., 2003). Предполагается, что промоторная область гена GPX1 связывает p53 (как транскрипционный фактор), что сопровождается повышением экспрессии GPX1 и стимуляцией апоптоза (Hussain et al., 2004).

Анализ метилирования CpG-островков в промоторных областях генов GPX1, RHOA и USP4 был выполнен методом МЧРА с применением 2-х метил-чувствительных рестриктаз HpaII и HhaI. Исследование проведено на образцах ПКР от 39 пациентов, РМЖ от 54 пациентов и на образцах НМКРЛ от 37 пациентов. Структурная организация генов, рестрикционная карта исследованных фрагментов и позиции праймеров показаны на рисунке 6.

Рисунок 6. Структурная организация генов USP4(А), GPX1(Б) и RHOA(В). Показаны положение ATG кодонов и CpG-островков. Также показаны, позиции праймеров, использованных при МЧРА для амплификации фрагмента USP4 (USP4-F и USP4-R; 598 п.н.)(А), для фрагмента GPX1 (GPX1-F и GPX1-R; 437 п.н.)(Б) и для фрагмента RHOA (RHOA-F, RHOA-R; 416 п.н.)(В). (>) - прямой праймер; (<) - обратный праймер.

Методом МЧРА определяли профиль метилирования 6 CpG-динуклеотидов в CpG-островке гена USP4, 12 CpG-динуклеотидов в CpG-островке гена GPX1 и 11 CpG-динуклеотидов в CpG-островке гена RHOA. Данные по частотам метилирования CpG-островков этих генов представлены в таблице 3. Для более полной картины был определен уровень метилирования каждого из генов, который рассчитывали как долю метилированных CpG-динуклеотидов в исследуемом фрагменте ДНК в данной выборке образцов(табл.3).

Таблица 3. Частоты и уровни метилирования CpG-островков генов USP4, GPX1 и RHOA в образцах ДНК ПКР, РМЖ и НМКРЛ и в образцах ДНК гистологически нормальной ткани.

* Под уровнем метилирования подразумевали долю метилированных CpG-динуклеотидов из суммарно исследованных для конкретного CpG-островка в расчете на все образцы данной выборки. За 100% принимали произведение количества CpG, исследованных в конкретном CpG-островке, на число случаев в соответствующей выборке. Уровень метилирования включает в себя как частоту встречаемости случаев метилирования, так и плотность метилирования (долю метилированных CpG в каждом случае).

При РМЖ выявлено достоверное повышение частоты метилирования гена USP4, а при ПКР уровня метилирования гена GPX1. Эти данные указывают на возможное участие этих генов в супрессии данных видов опухолей. При НМКРЛ, напротив, отмечено понижение частоты метилирования для гена USP4 и уровня метилирования для гена RHOA. Эти данные указывают на возможное участие этих генов в роли протоонкогенов при НМКРЛ. Вызывает интерес ген USP4, для которого в случае ПКР и НМКРЛ наблюдается деметилирование CpG-островка промоторной области гена, в то время как при РМЖ наблюдается прямо противоположная картина. Это может быть связано с ткане-специфичным характером метилирования CpG-островка гена USP4. Полученные данные согласуются с приведенными выше данными литературы по функциям этих генов в опухолевой клетке. В литературе нет сообщений по характеристике метилирования генов GPX1, RHOA и USP4 в опухолях. Таким образом, результаты по изменению метилирования этих генов при ПКР, РМЖ и НМКРЛ представлены нами впервые.