АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
Изменение метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3 человека в эпителиальных опухолях
03.00.03 - Молекулярная биология
кандидата биологических наук
Ходырев Дмитрий Сергеевич
Москва - 2009
Работа выполнена в Лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИгенетика»).
Научный руководитель:
доктор биологических наук Брага Элеонора Александровна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Карпухин Александр Васильевич ГУ Медико-генетический научный центр
доктор биологических наук, профессор Сломинский Петр Андреевич Институт молекулярной генетики РАН
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН
Защита состоится «10» ноября 2009г. в 1400 часов на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд,1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика».
Автореферат разослан «____» _____________ 2009 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета
кандидат химических наук Т.Л. Воюшина
метилирование опухоль молочный онкозаболевание
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Проблема онкологических заболеваний остается приоритетной для современного общества. По прогнозам ВОЗ заболеваемость и смертность от онкологических заболеваний во всем мире неуклонно растет и за период с 1999 года по 2020 год увеличится в 2 раза: с 10 до 20 млн. новых случаев. Учитывая, что в развитых странах наблюдается тенденция к замедлению роста заболеваемости и снижение смертности от злокачественных опухолей (как за счет антираковых программ, профилактики онкологических заболеваний, так и за счет улучшения ранней диагностики и лечения), то основной прирост придется на развивающиеся страны, к которым сегодня следует отнести и Россию.
Исследование молекулярно-биологических причин возникновения рака представляет одну из наиболее актуальных проблем здравоохранения. Согласно современным представлениям, важную роль в процессе канцерогенеза играют как генетические, так и эпигенетические факторы. Значительный прогресс в понимании механизмов канцерогенеза связан с открытием сначала онкогенов (и протонкогенов), или факторов позитивного контроля деления клеток, а затем - антионкогенов или генов-супрессоров опухолевого роста (TSG), осуществляющих негативный контроль клеточного роста. Онкогены активируются в опухолях по доминантному механизму и стимулируют развитие опухоли. Напротив, TSG инактивируются в опухолях по рецессивному типу с повреждением обоих родительских аллелей. В случае сохранности некоторых критичных TSG (например, гена p53) в клетке, подверженной неопластическим изменениям, эти TSG могут вызвать остановку клеточного цикла или ее программируемую смерть (апоптоз), и таким образом, остановить или замедлить опухолевый рост. TSG могут участвовать в подавлении нео-ангиогенеза, инвазии и метастазирования, в регуляции теломеразной системы. Некоторые TSG прямо или опосредованно участвуют в репарации мутаций, например, p53 задерживает клеточный цикл до исправления нарушений с помощью белков системы репарации. Все большая роль в регуляции экспрессии генов, связанных с развитием злокачественных опухолей, отводится метилированию CpG-островков в промоторных районах, а число работ, опубликованных в последнее десятилетие, превысило 14 тысяч. Изменение профиля метилирования промоторных районов некоторых генов является характерной чертой опухолевых клеток, причем аномальное метилирование наблюдается уже на ранних этапах канцерогенеза. Данное исследование посвящено изучению метилирования промоторных областей семи генов в эпителиальных опухолях почки, молочной железы и немелкоклеточного рака легкого, а также связи метилилирования промоторных районов этих генов с прогрессией данных видов рака. В данной работе проведен подбор систем маркеров, оптимальных для выявления и мониторинга данных социально-опасных видов рака, что является важной задачей молекулярной медицины и практической онкологии.
Цель и задачи исследования. Данная работа направлена на изучение метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3 с целью поиска молекулярных маркеров, а также подбора информативных систем маркеров, необходимых для ранней диагностики и мониторинга рака легкого, молочной железы и почки. В соответствии с указанной целью нами были поставлены следующие задачи:
1. Определение профиля метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3 (RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, RHOA, USP4, GPX1, NKIRAS1) в эпителиальных опухолях молочной железы, немелкоклеточного рака легкого и почечноклеточного рака.
2. Выявление возможных корреляций между уровнем метилирования этих генов и прогрессией опухоли, а также отбор молекулярных маркеров неблагоприятного прогноза онкозаболевания.
3. Подбор информативных систем маркеров, оптимальных для выявления и мониторинга данных видов опухолей.
Научная новизна работы. В данной работе впервые исследовано метилирование истинно промоторного CpG-островка гена SEMA3B и показано, что он метилирован в 1,5 раза чаще, чем известный ранее интронный CpG-островок при разных видах рака. Показана высокая частота метилирования промоторного района гена RAR-beta2 при почечно-клеточном раке и ее связь с прогрессией данного вида опухоли. Впервые исследованно метилирование промоторных районов генов RHOA, USP4, GPX1, NKIRAS1 в опухолях разных локализаций. Впервые установлено, что гены RHOA, USP4, NKIRAS1 представляют интерес как диагностические маркеры, изменения в метилировании которых можно обнаружить уже на ранней, доклинической стадии опухолевого процесса. Установлена достоверная положительная корреляция частоты метилирования гена RASSF1A со стадией и степенью анаплазии при раке молочной железы, а также, получены статистически достоверные корреляции изменения метилирования промоторных областей генов RHOA, USP4, GPX1, NKIRAS1 с различными клинико-гистологическими характеристиками, такими как стадия, степень анаплазии, размер опухоли и метастазирование в регионарные лимфатические узлы.
Практическая ценность работы. Показано, что изменение метилирования промоторных областей всех исследованных генов можно обнаружить уже на ранней стадии опухолевого процесса, что позволяет использовать данные маркеры для ранней диагностики рака. С другой стороны, достоверные корреляции между уровнем метилирования генов RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, RHOA, USP4, NKIRAS1 и клинико-гистологическими показателями опухолей позволяют использовать их в качестве молекулярных маркеров неблагоприятного прогноза онкозаболевания. Подобраны информативные системы маркеров, позволяющие с высокой чувствительностью выявить рак легкого (в 89% случаев), рак молочной железы (в 80% случаев) и почечно-клеточный рак (в 68% случаев).
Апробация работы. Диссертационная работа была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП “ГосНИИ генетика” от 15 апреля 2009г. Результаты настоящей работы доложены автором диссертации на международной конференции “Генетика в России и мире” (Москва, 2006), конференции по фундаментальной онкологии “Петровские чтения” (Санкт-Петербург, 2008), V конференции молодых ученых России с международным участием “Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины”(Москва, 2008), а также пятом сьезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 статей, а также тезисы докладов и сообщений на отечественных и международных конференциях.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 137 страницах машинописного текста и содержат 15 таблиц и 56 рисунков.
Содержание работы
1. Выборка образцов и методы исследований. Для исследования уровня метилирования промоторных районов генов RASSF1A, RAR-beta2, SEMA3B, RHOA, USP4, GPX1, NKIRAS1 была использована комбинация методов: 1) ПЦР-анализ образцов геномной ДНК, последовательно расщепленной с помощью набора метилчувствительных рестриктаз (МЧРА); 2) модификация геномной ДНК бисульфитом с последующей ПЦР, специфичной к метилированному аллелю гена (МС-ПЦР), или секвенированием ПЦР-продукта исследуемого фрагмента гена (бисульфитное секвенирование). Основные статистические методы - критерий Фишера, ранговая корреляция Спирмана с использованием t-теста Стьюдента.
Исследования были проведены с использованием 231 пары образцов ДНК, выделенных из опухолевых (Т) и морфологически нормальных (N) тканей. Выборка включала 83 случая светлоклеточного почечноклеточного рака (ПКР), 38 случаев рака легкого (НМКРЛ, наиболее представлены плоскоклеточная карцинома и аденокарцинома), 110 случаев рака молочной железы (РМЖ, преимущественно представлены случаи с инфильтративно-протоковой гистологией). Все исследованные нами опухоли были классифицированы клинически по системе TNM принятой Международным противораковым союзом, UICC-2002 г., и гистологически в соответствии с ВОЗ в отделе патоморфологии опухолей НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ РАМН. При отборе материала проводили дополнительный гистопатологический анализ микросрезов (3-5 мкм), что обеспечило отбор образцов с содержанием опухолевых клеток не менее 70%. Были использованы образцы опухолей только тех пациентов, которые до операции не получали лучевую или химиотерапию. В качестве контролей использовали лейкоциты переферической крови от 15 здоровых доноров и образцы тканей легкого, почки и молочной железы от 6 человек, онкологически здоровых в анамнезе.
2. Определение профиля метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3 (RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, RHOA, USP4, GPX1, NKIRAS1) в различных эпителиальных опухолях.
2.1. Изменение профилей метилирования промоторных областей генов RASSF1A и RAR-beta2 в эпителиальных опухолях.
Ген RASSF1A (Ras Association Domain Family 1A) локализован в районе 3p21.31 короткого плеча 3 хромосомы (3p). Этот ген протяженностью 7.6 т.п.н. содержит 5 экзонов и кодирует м-РНК длиной 2 т.н. Белковый продукт RASSF1A относится к цитоплазматическим белкам. Выявлено многообразие функций этого белка в клетке, например, задержка клеточного цикла (Shivakumar et al., 2002), участие в индукции апоптоза за счет взаимодействия с продуктом онкогена ras (Vos et al., 2000) или гена MST1 (Oh et al., 2006), стабилизация микротрубочек (Пфайфер и Дамманн., 2005). Супрессорная активность гена RASSF1A подтверждена и с помощью нокаут-мутаций гена в клетках мыши (Tommasi et al., 2005).
Ген RAR-beta2 локализован в районе 3р24 относится к суперсемейству ядерных рецепторов, которые служат лиганд-активирующими транскрипционными факторами (Chambon et al., 1996). Лигандами для рецепторов класса RAR являются ретиноиды - витамин А и его биологически активные метаболиты. Известно, что ретиноиды способны ингибировать пролиферацию клеток и индуцировать клеточную дифференцировку. В связи с этим, их используют для профилактики и терапии различных опухолей (Hong et al., 1995). Во многих случаях метилирование промоторной области данного гена было обнаружено в предраковых новообразованиях, и частота метилирования возрастала с прогрессией заболевания и образованием карцином (Feng et al., 2007; Fendri et al., 2009; Garcнa et al., 2009).
Физические карты промоторных районов генов RASSF1A и RAR-beta2 представленны на рисунке 1а и 1б. На рис. 1 показаны CpG-динуклеотиды анализируемых фрагментов и позиции праймеров, использованных в данной работе. При анализе гена RASSF1A применяли метод МС-ПЦР, а RAR-beta2 - метод МЧРА, с использованием 3-х метил-чувствительных рестриктаз - HpaII, Bsh1236I, AciI и бисульфитное секвенирование. Для RASSF1A исследованы 76 случаев ПКР, 110 случаев РМЖ и 32 случая НМКРЛ, для RAR-beta2 - 61, 56 и 37,соответственно.
Рисунок. 1. Физические карты промоторных районов генов RASSF1A (А) и RAR-beta2 (Б). Показаны экзоны гена, начало 1-го экзона (+1). A. Праймеры для МС-ПЦР (M/U-L и M/U-R), показаны белым цветом на сером фоне. Б. Показаны праймеры использованные для бисульфитного секвенирования (Rar-m-F и Rar-m-R, белым цветом на темно-сером фоне), для МЧРА (RAR-F1 и RAR-R1) и для контроля сохранности препарата ДНК после рестрикции (RAR-F2 и RAR-R1); стрелками отмечены прямые (>) и обратные праймеры (<).
На рисунке 2 приведены примеры анализа метилирования CpG-островка гена RASSF1A (2а,2в) и гена RAR-beta2 (2б).
Рисунок 2.
А. Примеры типичных результатов анализа метилирования промоторной области гена RASSF1A с применением метода МС-ПЦР в 2-х образцах ПКР 199 и 333. Электрофоретическое разделение в 10%-ном ПААГ продуктов МС-ПЦР, полученных для образцов ДНК ПКР. ПЦР проводили на ДНК, конвертированной бисульфитом. Исследован фрагмент гена RASSF1A, 168 п.н. Показаны продукты ПЦР, специфичной к метилированному (M) и неметилированному (U) аллелю. В качестве позитивного контроля 100%-ого метилирования ДНК, использовали ДНК плаценты (placental tissue DNA) после обработки метилтрансферазой SssI (SssI). ДНК из лимфоцитов крови использовали как контроль для неметилированных аллелей (limph). К(-) - отрицательный контроль (в отсутствии ДНК). L - маркер с шагом 10 п.н.
Б. Примеры применения МЧРА для гена RAR-beta2: Электрофоретическое разделение в 2% агарозном геле продуктов ПЦР для 2-х образцов ДНК ПКР, до(T/N) и после (T+/N+) гидролиза рестриктазой Bsh1236I. Исследуемый фрагмент гена RAR-beta2 - 680 п.н.; Контроль на полноту рестрикции (K2) - фрагмент гена beta-3А-адаптина, 445 п.н.; контроль сохранности ДНК (K1) - фрагмент экзона 3 гена RAR-beta2, 229 п.н.; К(-) - отрицательный контроль (в отсутствии ДНК). М - маркер с шагом полос 100 п.н.; T - продукт амплификации ДНК из опухолевой ткани; N - продукт амплификации ДНК из нормальной ткани.
В. Проверка полноты бисульфитной конверсии с применением праймеров, гомологичных фрагменту гена в исходной ДНК, не модифицированной бисульфитом: электрофоретическое разделение в 10%-ном ПААГ продуктов ПЦР. Исследован фрагмент гена RASSF1A, 168 п.н. ПЦР проводили на исходных препаратах ДНК (T/N) и на образцах ДНК, конвертированных бисульфитом (T(+)/N(+)). L - маркер с шагом 10 п.н.
Пример результатов анализа метилирования промоторных областей 2-х генов схематически представлены на рисунке 3.