Рис. 4 Зависимость между клиренсом осмотически активных веществ и реабсорбцией осмотически свободной воды после инъекции 0.05 нмоль АВТ на 100 г массы тела на фоне водной нагрузки
По оси абсцисс - клиренс осмотически активных веществ (UOsmV в мл/мин?100 г массы тела); по оси ординат - реабсорбция осмотически свободной воды (ТСН2О в мл/мин?100 г массы тела).
Для АВП, АВТ и его аналогов при введении на фоне водной нагрузки была исследована зависимость антидиуретического и натрийуретического эффектов от дозы. Сила антидиуретического действия растет пропорционально увеличению дозы АВТ и его аналогов (рис. 5), как и при введении АВП. Инъекция АВТ, 1dАВТ, 1d1мкАВТ и 1dDАВТ в дозе 0.0001 нмоль на 100 г массы тела оказывает в разной степени выраженное антидиуретическое действие без влияния на экскрецию ионов. Оно выражается в уменьшении мочеотделения и снижении экскреции осмотически свободной воды. Агонист V2-рецепторов - dDAВП оказывает более выраженное антидиуретическое действие по сравнению с 1dDАВТ: за 2 ч наблюдения диурез после инъекции 0.0001 нмоль на 100 г массы тела 1dDАВТ составил 2.4 ± 0.3 мл/100 г массы тела, а после введения dDAВП - 0.9± 0.1 мл/100 г массы тела (p<0.01). В дозе 0.05 нмоль на 100 г массы тела АВТ и все исследованные аналоги (1dАВТ, 1d1мкAВT, 1dDAВT, DАВТ) проявляют антидиуретическое свойство.
Рис. 5 Зависимость реабсорбции осмотически свободной воды и выделения ионов натрия от дозы пептидов, инъецированных крысам на фоне водной нагрузки
По оси абсцисс - доза пептида в нмоль/100 г массы тела; по оси ординат - (а) реабсорбция осмотически свободной воды (ТСН2О в мл/100 г массы тела за 120 мин), (б) экскреция ионов натрия (UNaV в мкмоль/100 г массы тела за 120 мин).
При этом 1dАВТ и 1d1мкАВТ оказывают более выраженное влияние на почку крыс, чем АВТ (табл. 1). Они резко увеличивают реабсорбцию воды и выделение почкой осмотически активных веществ, главным образом, ионов натрия, а также калия и магния. Натрийуретическая реакция почки длится в течение 2 ч, ей соответствует пик диуреза (рис. 6) и реабсорбции осмотически свободной воды. Антидиуретический эффект в целом более пролонгированный: за 7 ч наблюдения после введения 1dАВТ и 1d1мкАВТ от введенной в желудок воды выводится только 36.9 ± 3.5 % и 31.9 ± 2.7 %, соответственно. Клиренс эндогенного креатинина не изменялся, что указывает только на канальцевый эффект пептидов. Таким образом, антидиуретическое действие АВТ, 1dАВТ и 1d1мкАВТ проявляется в меньших дозах, а для выявления натрийуретического эффекта требуется применение бьльших доз.
Таблица 1 Показатели деятельности почки крыс после инъекции 0.05 нмоль АВТ и аналогов на 100 г массы тела на фоне водной нагрузки.
|
Параметры+ |
H2O (n=28) |
АВТ (n=69) |
1dАВТ (n=24) |
1d1мкАВТ (n=11) |
1dDАВТ (n=20) |
DАВТ (n=27) |
|
|
V, мл V, % CН2О, мл Соsm, мл СNa, мл СNaН2О, мл UNaV, мкмоль UKV, мкмоль UMgV, мкмоль UоsmV, мкосм |
4.27±0.11 85.9±2.2 2.9±0.1 1.3±0.1 0.28±0.05 3.96±0.10 39±8 25±3 1.1±0.2 386±28 |
0.89±0.06* 17.7±1.1* -1.1±0.1* 2.0±0.1* 1.22±0.09* -0.30±0.06 169±12* 40±3* 1.4±0.3ns 612±33* |
1.90±0.13*$ 37.3±2.5*$ -2.8±0.2*$ 4.7 ±0.3*$ 3.22±0.23*$ -1.35±0.23*$ 444±32*$ 95±11*$ 3.1±1*$ 1386±81*$ |
1.40±0.12*$ 28.2±2.4*$ -2.6±0.2*$ 4.0±0.3*$ 3.20±0.24*$ -1.80±0.15*$ 442±33*$ 88±9*$ 4.7±0.5*$ 1201±78*$ |
0.37±0.05*$ 7.3±0.9*$ -1.0±0.1*Ns 1.4±0.1ns$ 0.29±0.07ns$ 0.07±0.07*$ 40±9ns$ 31±4ns$ 2.4±0.4*Ns 416±40ns$ |
0.51±0.05*$ 10.5±1.3*$ -0.5±0.1*$ 1.0±0.1*$ 0.19±0.03ns$ 0.32±0.06*$ 26±4ns$ 17±1*$ 1.4±0.2nsNs 295±21*$ |
Примечание. Достоверность отличий по сравнению с водной нагрузкой: * p<0.05, ns - недостоверно; по сравнению с АВТ: $ p<0.05, Ns - недостоверно.
+Все данные рассчитаны за период 120 мин на 100 г массы тела животного.
V, % - выведение мочи в % от объема введенной воды в желудок.
Исследование механизма влияния АВТ и его аналогов на транспорт воды и ионов в почке млекопитающих.
Исследование роли V1- и V2-рецепторов в реализации эффектов АВТ и 1dАВТ на выделение ионов натрия и воды почкой. С целью исследования роли стимуляции разных типов рецепторов вазопрессина в натрийуретическом эффекте АВТ животным внутрибрюшинно инъецировали антагонист V1- или V2-рецепторов и вслед за этим на фоне водной нагрузки внутримышечно вводили 0.05 нмоль АВТ на 100 г массы тела. Мочеотделение возрастает как после введения воды в желудок, так и после инъекции АВТ. В основе роста диуреза после введения воды лежит повышение экскреции осмотически свободной воды, а увеличение мочеотделения после инъекции АВТ коррелирует с увеличением экскреции ионов натрия. Антагонист V1- рецепторов устраняет способность
Рис. 6 Динамика мочеотделения у крыс после введения воды в желудок и инъекции 0.05 нмоль АВТ или аналогов на 100 г массы тела
По оси абсцисс - время в мин; по оси ординат - диурез (V в мл/мин?100 г массы тела). Стрелка - введение 5 мл воды на 100 г массы тела зондом в желудок и инъекция в мышцу 0.05 нмоль АВТ или аналогов на 100 г массы тела. АВТ усиливать диурез из-за снижения натрийуретической реакции. Антагонист V2-рецепторов уменьшает эффект АВТ на реабсорбцию воды, в результате на смену повышенной реабсорбции воды происходит экскреция осмотически свободной воды и усиливается водный диурез (рис. 7). В другой серии опытов антагонист V1- или V2-рецепторов вводили зондом в желудок и вслед за этим крысам внутримышечно инъецировали 0.05 нмоль 1dАВТ на 100 г массы тела. После введения антагониста V1-рецепторов не происходит видимых изменений экскреции мочи почкой крыс. Введение антагониста V2-рецепторов вызывало увеличение мочеотделения, что было связано с устранением влияния эндогенного АВП на реабсорбцию воды. Пик диуреза, наблюдающийся в течение первого часа после инъекции 1dАВТ и обусловленный натрийурезом, полностью снимался при введении антагониста V1-рецепторов. Д.Ю. Мордвинцевым (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук) осуществлено компьютерное моделирование V1a-, V1b- и V2-рецепторов и даны расчеты энергии взаимодействия исследованных нами лигандов с этими рецепторами. Нами эти данные сопоставлены с действием пептидов на выделение воды и ионов почкой in vivo. Сравнение влияния АВТ и его аналогов в дозе 0.0001 нмоль на 100 г массы тела на реабсорбцию почкой осмотически
Рис. 7 Динамика мочеотделения у крыс после инъекции 0.05 нмоль АВТ и 130 мкг антагониста V1- или V2-рецепторов на 100 г массы тела на фоне водной нагрузки
По оси абсцисс - время в мин; по оси ординат - (а) диурез (V в мл/мин?100 г массы тела), (б) клиренс осмотически свободной воды (CН2О в мл/мин?100 г массы тела), (в) экскреция ионов натрия с мочой (UNaV в мкмоль/мин?100 г массы тела). Стрелка - введение в желудок воды в объеме 5 мл на 100 г массы тела, одновременная инъекция в мышцу 0.05 нмоль AВT и внутрибрюшинное введение 130 мкг антагониста V1- или V2-рецепторов на 100 г массы тела.
свободной воды после введения водной нагрузки и энергии их взаимодействия с V-рецепторами выявило корреляцию (r=0.772, p<0.05) при взаимодействии различных пептидов с V2-рецептором (рис. 8). Для V1a- и V1b-рецепторов такой зависимости не обнаружено (r=0.374, p>0.05 и r=0.628, p>0.05, соответственно). Также была исследована зависимость между энергией взаимодействия пептидов с V2-рецептором и дозой, необходимой для снижения экскреции осмотически свободной воды на 50 % после введения животным водной нагрузки. Очевидно, что необходимы различные количества аналогов гормонов в зависимости от аффинности лигандов к рецептору. Исключительно высокая корреляция (r=0.974, p<0.05) выявлена при сопоставлении реабсорбции осмотически свободной воды и энергии взаимодействия с V2-рецептором AВТ, DАВТ, dDАВТ и dDАВП.
Рис. 8 Зависимость между клиренсом осмотически свободной воды после инъекции 0.0001 нмоль пептидов на 100 г массы тела на фоне водной нагрузки и энергией взаимодействия с V2-рецептором
По оси абсцисс - клиренс осмотически свободной воды (СН2О в мкл/мин?100 г массы тела); по оси ординат - энергия взаимодействия с V2-рецептором (Е в кДж/моль).
Исследование роли ПГЕ2, атриопептида, цАМФ, цГМФ в реализации эффекта АВТ и его аналогов. Экспериментально была проанализирована возможность секреции ПГE2 в ответ на инъекцию АВТ и его аналогов. Уровень выведения ПГЕ2 практически одинаков у животных из группы контроля и после введения воды. После инъекции пептидов с натрийуретической активностью (0.05 нмоль на 100 г массы тела АВТ и 1d1мкАВТ, 0.005-0.05 нмоль на 100 г массы тела 1dАВТ) выявлена положительная корреляция (r=0.356, p<0.05) между выведением ПГЕ2 и экскрецией ионов натрия (рис. 9).
Рис. 9 Зависимость между выведением ПГЕ2 и экскрецией ионов натрия почкой крыс после инъекции АВТ и его аналогов
По оси абсцисс - экскреция ПГЕ2 (UПГЕ2V в пг/100 г массы тела за 120 мин); по оси ординат - экскреция ионов натрия (UNaV в мкмоль/100 г массы тела за 120 мин).
Введение неселективного ингибитора циклооксигеназы диклофенака натрия за 45 мин до инъекции 1dАВТ приводит к снижению выведения с мочой ПГЕ2 до уровня контроля, уменьшению реабсорбции осмотически свободной воды и экскреции ионов натрия (табл. 2).
Увеличение экскреции натрия могло быть следствием усиления секреции одного из натрийуретических гормонов под влиянием аналогов АВТ.
Для проверки возможности стимуляции секреции атриопептида в ответ на введение АВТ или 1dАВТ с его последующим влиянием на выделение ионов натрия была изучена концентрация proANP(1-98) в сыворотке крови после инъекции 0.05 нмоль на 100 г массы тела АВТ и 1dАВТ (табл. 3).
Концентрация proANP(1-98) в сыворотке крови достоверно не изменялась, как и после введения 5 % водной нагрузки или в первые 10-30 мин после инъекции 0.05 нмоль АВП на 100 г массы тела. Следовательно, натрийуретическое действие АВТ и 1dАВТ не связано с усилением секреции атриопептида.
Таблица 2 Показатели деятельности почки крыс после инъекции 0.05 нмоль 1dАВТ и 0.5 мг диклофенака натрия на 100 г массы тела.
|
Параметры+ |
Контроль (n=19) |
1dАВТ 0.05 нмоль (n=10) |
Диклофенак натрия 0.5 мг + через 45 мин 1dАВТ 0.05 нмоль (n=10) |
|
|
V, мл ССr, мл/мин CН2О, мл СOsm, мл СNa, мл СNaН2О, мл UNaV, мкмоль UKV, мкмоль UMgV, мкмоль UOsmV, мкосм UПГЕ2V, нг |
0.16±0.03 0.18±0.02 -0.4±0.1 0.5±0.1 0.11±0.03 0.05±0.02 15±4 14±1 2.7±0.4 159±25 3.3±0.4 |
1.33±0.20* 0.40±0.05* -1.8±0.1* 3.1±0.3* 2.25±0.30* -0.92±0.11* 311±41* 66±7* 6.7±1.1* 938±94* 9.4±1.6* |
0.51±0.10*$ 0.34±0.03*Ns -1.3±0.1*$ 1.9±0.2*$ 0.91±0.13*$ -0.29±0.07*$ 125±18*$ 87±9*Ns 2.6±0.6 ns$ 576±67*$ 2.7±0.5 ns$ |
Примечание. Достоверность отличий по сравнению с контролем: * p<0.05, ns - недостоверно; по сравнению с 1dАВТ: $ p<0.05, Ns - недостоверно.
+Все данные рассчитаны за период 120 мин на 100 г массы тела животного (за исключением ССr).
С целью выяснения роли различных вторичных мессенджеров в реализации эффектов 1dАВТ, исследовали экскрецию почкой цАМФ и цГМФ. Сопоставление реабсорбции осмотически свободной воды и выделения с мочой цАМФ (рис. 10а) после инъекции 0.005-0.05 нмоль 1dAВТ на 100 г массы тела выявило их положительную корреляцию (r=0.652, p<0.01). В ответ на инъекцию 1dАВТ выявлена корреляционная связь (r=0.509, p<0.05) между выделением натрия почкой и цГМФ (рис. 10б). Можно думать, что увеличение реабсорбции осмотически свободной воды включает участие цАМФ, а повышение экскреции натрия - цГМФ.
Таблица 3 Динамика концентрации proANP(1-98) в сыворотке крови после инъекции 0.05 нмоль АВТ или 1dАВТ на 100 г массы тела
|
Время после инъекции, мин |
Концентрация proANP(1-98) в крови, пмоль/мл |
||
|
АВТ |
1dАВТ |
||
|
0 мин 10 мин 20 мин 30 мин 60 мин |
3.8±0.3 (22) 3.0±0.2 (10) NS 3.0±0.3 (10) NS 3.7±0.5 (10) NS - |
3.8±0.3 (22) 3.6±0.3 (10) NS 4.5±0.4 (20) NS 4.1±0.3 (10) NS 3.1±0.4 (10) NS |
Примечание. Достоверность по отношению к исходному уровню концентрации: NS - недостоверно. В скобках - количество животных.
Рис. 10 Корреляция между выведением цАМФ и реабсорбцией осмотически свободной воды, выведением цГМФ и экскрецией ионов натрия после инъекции 0.005-0.05 нмоль 1dАВТ на 100 г массы тела
По оси абсцисс - (а) экскреция цАМФ (UцАМФV в пмоль/100 г массы тела за 120 мин), (б) экскреция цГМФ (UцГМФV в пмоль/100 г массы тела за 120 мин); по оси ординат - (а) реабсорбция осмотически свободной воды (ТСН2О в мл/100 г массы тела за 120 мин), (б) экскреция ионов натрия (UNaV в мкмоль/ 100 г массы тела за 120 мин).
Сопоставление особенностей действия фуросемида и аналогов АВТ.
Для исследования локуса натрийуретического действия 1dАВТ в нефроне было сопоставлено его влияние c действием фуросемида. С этой целью проведены эксперименты с одновременным введением обоих веществ. Экскреция натрия за 2 ч после инъекции 1 мг на 100 г массы тела фуросемида и 0.05 нмоль на 100 г массы тела 1dАВТ была сходна: 364 ± 34 мкмоль/100 г массы тела и 318 ± 24 мкмоль/100 г массы тела, соответственно (p>0.05). Основной механизм действия фуросемида - инактивация Na+,K+,2Cl--котранспортера с люминальной стороны мембран клеток толстого восходящего отдела петли Генле. Так как совместное введение этих веществ не добавило количества натрия, экскретируемого с мочой (401 ± 65 мкмоль/100 г массы тела за 2 ч, p>0.05), местом действия 1dАВТ, по-видимому, является толстый восходящий отдел петли Генле.
Для оценки силы натрийуретического действия 1d1мкАВТ и 1dАВТ их влияние на почку крыс было сопоставлено c действием фуросемида. Для расчета количества молей экскретируемого натрия на моль введенного пептида или фуросемида (МхNa) была разработана следующая формула:
МхNa=UNaV/Tх,
где UNaV - количество выделенного почкой натрия за время действия вещества «Х» (Tх - инъецированное количество этого вещества). Это вещество частично разрушается, выделяется разными органами, но эффект того количества, которое действует в почке, приводит к увеличению экскреции натрия. В случае инъекции 0.5 мг фуросемида на 1 молекулу почка реагирует экскрецией 141 иона Na+, на 1 молекулу введенного 1d1мкАВТ (0.05 мкг на фоне водной нагрузки) - 8220000 этих ионов. Пептид оказывается эффективнее фуросемида, одного из наиболее сильных современных салуретиков, почти в 60000 раз. Пептида инъецировано 0.05 нмоль, фуросемида - 1.51 мкмоль, т.е. для получения сопоставимого действия необходимо инъецировать более чем в 30000 раз больше молекул фуросемида. При аналогичных расчетах 1dАВТ (0.05 нмоль) оказывается эффективнее фуросемида (1.0 мг) более чем в 50000 раз. Эффект пептидов длится дольше, потому суммарный результат еще выше. Принципиальным физиологическим отличием реакции почки является возрастание реабсорбции осмотически свободной воды на максимуме диуреза после введения 1d1мкАВТ (22.6 ± 1.8 мкл/мин?100 г массы тела) или 1dАВТ (21.5 ± 1.1 мкл/мин?100 г массы тела) и отсутствие такого эффекта после введения фуросемида (-8.0 ± 2.8 мкл/мин?100 г массы тела).