Размещено на http: //www. allbest. ru/
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
03.00.13 - Физиология
Исследование влияния синтезированных аналогов аргинин-вазотоцина на функции почки крыс
Канашкина Татьяна Анатольевна
Санкт-Петербург 2007
Работа выполнена в лаборатории физиологии почки и водно-солевого обмена Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук
Научный руководитель
академик РАН Юрий Викторович Наточин
Официальные оппоненты
доктор медицинских наук, профессор Николай Павлович Ерофеев
доктор медицинских наук, профессор Ратмир Сергеевич Орлов
Ведущее учреждение
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова МО РФ
Защита состоится 29 мая 2007 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002. 127. 01 при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук по адресу: Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук
Автореферат разослан апреля 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Марина Николаевна Маслова
1. Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. В физиологии почки и в клинической практике, связанной с решением проблем лечения отеков, гипо- и гипернатриемии, вопрос о регуляции реабсорбции натрия остается одним из наиболее актуальных и дискуссионных. Установлена роль альдостерона, атриопептида, вазопрессина в изменении выделения натрия и воды почкой. Недавно было показано, что у аргинин-вазотоцина (АВТ) при его введении крысам имеются уникальные свойства воздействия на водно-солевой обмен - он увеличивает экскрецию солей натрия и одновременно повышает реабсорбцию осмотически свободной воды в почке (Гао, Наточин, 2004). В то же время известные натрийуретические гормоны (Beltowski, Wojcicka, 2002; Елисеев, 2003; Antunes-Rodrigues et al., 2004) и петлевые диуретики (Greger, Wangemann, 1987; Uechi et al., 2003) усиливают натрийурез, но при этом не влияют на проницаемость канальцев для воды. Своеобразие действия на функцию почки АВТ открывало возможность исследования новых механизмов регуляции транспорта ионов натрия в почке и поиска более активных соединений, влияющих на реабсорбцию этих ионов. Целесообразность синтеза новых аналогов АВТ и исследования их влияния на почку обусловлена тем, что среди них могли оказаться физиологически активные вещества, тормозящие реабсорбцию натрия и способствующие быстрой экскреции его избытка из организма.
Цель исследования. Изучение влияния синтезированных аналогов АВТ на осмо- и ионорегулирующую функции почки у крыс, выяснение физиологических механизмов натрийуретического действия АВТ и его аналогов.
Задачи исследования.
1. Сравнительное исследование влияния аргинин-вазопрессина (АВП), АВТ и синтезированных аналогов АВТ - 1-дезамино-Arg8-вазотоцина (1dАВТ), 1-дезамино-1-монокарба-Arg8-вазотоцина (1d1мкАВТ), 1-дезамино-D-Arg8-вазотоцина (1dDАВТ) и D-Arg8-вазотоцина (DАВТ) на экскрецию воды и ионов натрия, калия, магния почкой крыс при стандартном водном режиме и на фоне водной нагрузки.
2. Исследование роли V1- и V2-рецепторов в реализации эффектов нонапептидов на выделение ионов натрия и воды почкой.
3. Исследование роли простагландина Е2 (ПГЕ2), атриопептида, цАМФ, цГМФ в реализации натрийуретического эффекта АВТ и его аналогов.
4. Сопоставление особенностей действия фуросемида и аналогов АВТ на функции почки крыс.
Научная новизна. Впервые показано антидиуретическое действие синтезированных аналогов АВТ - 1dАВТ, 1d1мкАВТ, 1dDАВТ, DАВТ у крыс. Впервые установлено, что 1dАВТ и 1d1мкАВТ у крыс вызывают исключительно высокую экскрецию натрия почкой, которая более чем в 50000 раз в молярном отношении превышает действие фуросемида; эти вещества одновременно увеличивают реабсорбцию осмотически свободной воды в канальцах. Впервые показано, что натрийуретический эффект аналогов АВТ обусловлен стимуляцией V1-рецепторов. Впервые показана высокая корреляция между энергией взаимодействия изученных пептидов с V2-рецептором и увеличением реабсорбции воды в почке крыс in vivo.
Научно-практическое значение работы. Результаты исследования имеют фундаментальное значение для понимания механизма натрийуретической функции почки, они могут стать основой создания средств коррекции нарушений обмена натрия в организме. Усиление натрийуретического влияния у новых аналогов АВТ может найти применение при необходимости увеличить выделение натрия и сохранить воду в организме, что важно для обеспечения стабильной осмоляльности крови у человека. Полученные в работе результаты используются в курсах лекций по физиологии для студентов медицинского факультета Санкт-Петербургского государственного университета.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Синтезированные аналоги АВТ - 1dDАВТ и DАВТ обладают антидиуретическим эффектом на почку крыс. Выраженное пролонгированное антидиуретическое и натрийуретическое действие оказывают 1dАВТ и 1d1мкAВT.
2. Антидиуретическая реакция почки крыс на введение АВТ и его аналогов связана с активацией V2-рецепторов собирательных трубок. Натрийуретическое действие, обусловленное активацией V1-рецепторов, включает участие цГМФ, ПГЕ2 и, по-видимому, реализуется в толстом восходящем отделе петли Генле.
3. 1dAВT и 1d1мкAВT в молярном отношении вызывают более чем в 50000 раз большее усиление выделения натрия почкой крыс по сравнению с высокой дозой фуросемида.
Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на Всероссийской конференции молодых исследователей “Физиология и медицина“ (Санкт-Петербург, 2005), на II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005) и девятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей “Человек и его здоровье” (Санкт-Петербург, 2006).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи в отечественных реферируемых журналах и тезисы 3-х докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 262 источника. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 44 рисунками. вазопрессин почка крыса натрийуретический
2. Материалы и методы исследования
Эксперименты проводили на ненаркотизированных самках крыс линии Вистар в возрасте 3-6 месяцев с массой тела 150-200 г. Опыты выполнены в соответствии с международными стандартами по работе с экспериментальными животными. Функция почки крыс исследовалась при стандартном водном режиме и на фоне введения с помощью резинового зонда через рот в желудок воды в объеме 5 мл на 100 г массы тела для торможения секреции эндогенного АВП. Ненаркотизированные животные помещались в клетки-пеналы с полом из металлической сетки, через отверстия которого моча стекала по воронке в пробирку. Выделение мочи регистрировали при спонтанном мочеотделении, измеряли объем и забирали для дальнейшего исследования. Кровь получали из сонной артерии под эфирным наркозом.
В сыворотке крови и моче осмоляльность определяли криоскопическим методом на миллиосмометре МТ-4 (Буревестник, Россия) и микроосмометре 3300 (Advanced Instruments, Inc., США), концентрацию креатинина - по реакции с пикриновой кислотой на спектрофотометре UNICO-2100 с проточной кюветой (Япония), концентрацию ионов магния - в воздушно-ацетиленовом пламени на атомном абсорбционном спектрофотометре Hitachi-508 (Япония). Исследование концентрации ионов натрия и калия в сыворотке крови проводили на анализаторе электролитов AVL 9140 (США), в моче концентрацию ионов натрия и калия измеряли в воздушно-пропановом пламени на пламенном фотометре Corning - 410 (Великобритания). Для определения концентрации ПГЕ2, цAMФ, цГMФ в моче использовали наборы для иммуноферментного анализа (RD Systems, Великобритания), для измерения proANP(1-98) в сыворотке крови - наборы для иммуноферментного анализа (Biomedica Medizinprodukte GmbH & Co KG, Австрия). Измерение оптической плотности и расчет концентрации ПГЕ2, цAMФ, цГMФ и proANP(1-98) осуществляли на автоматическом ридере ELх800 (BIO-TEK Instruments, США) по методикам соответствующих тест-систем.
Использованные реактивы: гормоны - АВП и АВТ (Sigma Chemical Co, США), аналоги АВТ - 1dАВТ, 1d1мкAВT, 1dDAВT и DAВT (ЗАО «Синтез пептидов», Россия), агонист V2-рецепторов - dDAВП (Sigma Chemical Co, США), антагонисты V1-рецепторов - ОРС-21268 и V2-рецепторов - ОРС-31260 (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Япония), блокатор циклооксигеназы - диклофенак натрия (Natur Produkt Europe B.V., Нидерланды), фуросемид (Hoechst, Индия).
Данные статистически обработаны и представлены в виде M ± m. Для сравнения и оценки межгрупповых различий использовали тест ANOVA и непарный t-критерий Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при p<0.05. Применяли корреляционный анализ.
3. Результаты исследования
Исследование влияния аналогов АВТ на выделение воды и ионов почкой крыс.
В контрольной группе крыс почка функционирует в состоянии антидиуреза в результате секреции эндогенного антидиуретического гормона, и происходит реабсорбция осмотически свободной воды. После инъекции в мышцу бедра крысам 1dАВТ увеличивался диурез, выделение ионов натрия, и наблюдалось повышение реабсорбции осмотически свободной воды. Выявлена прямая зависимость между дозой инъецируемого 1dАВТ и его антидиуретическим и натрийуретическим эффектами (рис. 1). В дозе 0.05 нмоль на 100 г массы тела он оказывает сильное натрийуретическое действие, дальнейшее
Рис. 1 Зависимость реабсорбции осмотически свободной воды и выделения ионов натрия почкой крыс от дозы инъецированного 1dАВТ
По оси абсцисс - доза 1dАВТ в нмоль/100 г массы тела; по оси ординат - (а) реабсорбция осмотически свободной воды (ТСН2О в мл/100 г массы тела за 120 мин), (б) экскреция ионов натрия (UNaV в мкмоль/100 г массы тела за 120 мин).
увеличение дозы не представлялось возможным в связи с чрезмерно выраженным антидиуретическим эффектом у этого аналога. После инъекции 0.05 нмоль 1dАВТ на 100 г массы тела крыс в течение первых 30 мин возрастал диурез, одновременно увеличивалась реабсорбция осмотически свободной воды. Усиливалось выведение осмотически активных веществ, экскреция ионов натрия возрастала в 47.5 раз, калия - в 7.7 раз, магния - в 4.8 раза (рис. 2). Повышение мочеотделения длилось в течение почти 2 ч, максимум реакции отмечался на 35-й мин. Подобное влияние на функции почки оказывали инъекции 0.05 нмоль на 100 г массы тела как АВТ, так и 1d1мкАВТ. Динамика увеличения диуреза и экскреции ионов натрия, калия, магния весьма сходна. 1dАВТ в этой дозе обладает более выраженным антидиуретическим и натрийуретическим действием по сравнению с АВТ (рис. 3). После инъекции 0.05 нмоль на 100 г массы тела DАВТ или 1dDАВТ натрийуретической реакции почки крыс не отмечалось. При действии всех изученных пептидов выявлен высокий коэффициент корреляции между экскрецией ионов натрия и калия (r=0.674, p<0.01, n=47).
Рис. 2 Динамика выведения почкой крыс осмотически активных веществ, Na+, K+, Mg++ после инъекции 0.05 нмоль 1dАВТ на 100 г массы тела
По оси абсцисс - время в мин; по оси ординат - экскреция осмотически активных веществ (UOsmV в мкосм/мин?100 г массы тела), ионов натрия (UNaV в мкмоль/мин?100 г массы тела), калия (UKV в мкмоль/мин?100 г массы тела) и магния (UMgV в мкмоль/мин?100 г массы тела). Стрелка - инъекция в мышцу 0.05 нмоль 1dАВТ на 100 г массы тела; 1 - UOsmV, 2 - UNaV, 3 - UKV, 4 - UMgV.
После введения в желудок воды в объеме 5 % к массе тела в течение 2 ч выводится 85.9 ± 2.2 % введенной воды, количество осмотически свободной воды, выделяемой почкой за это время, равно 58 % от введенного объема воды. При введении водной нагрузки в результате подавления секреции эндогенного вазопрессина максимально реализуется водовыделительная функция почки. Иньекция 0.05 нмоль АВП на фоне водной нагрузки приводит к резкому уменьшению диуреза за счет увеличения реабсорбции осмотически свободной воды, но при этом не наблюдается повышение экскреции осмотически активных веществ. За 7 ч после инъекции АВП крысам почки выделили 12.2 ± 4.8 % от введенной в желудок воды. При инъекции такой же дозы АВТ наблюдается выраженная экскреция осмотически активных веществ, ионов натрия, и, соответственно, меньшее снижение диуреза. Осмоляльное очищение после инъекции АВТ по сравнению с исходным уровнем возрастает на максимуме реакции более чем на порядок. При введении в желудок 5 мл воды на 100 г массы тела выявлена прямая зависимость между увеличением диуреза и экскрецией осмотически свободной воды (r=0.980, p<0.01), а после инъекции 0.05 нмоль АВТ на 100 г массы тела - между повышением диуреза и одновременным возрастанием реабсорбции осмотически свободной воды (r=0.800, p<0.01), и высокая корреляция (r=0.938, p<0.01) между осмоляльным очищением и реабсорбцией осмотически свободной воды (рис. 4). Это говорит о том, что повышение экскреции осмотически активных веществ после инъекции пептида влечет за собой возрастание реабсорбции осмотически свободной воды. Экскретируемая фракция осмотически активных веществ возрастает с 2.6 ± 0.2 % до 11.9 ± 1.2 % (p<0.001), что указывает на канальцевый эффект гормона. Поскольку концентрация электролитов в сыворотке крови не отличалась от контроля, источником увеличенного очищения от осмотически активных веществ могло быть снижение их реабсорбции только в дистальном сегменте нефрона.
Рис. 3 Динамика мочеотделения у крыс после инъекции 0.05 нмоль АВТ и его аналогов на 100 г массы тела
По оси абсцисс - время в мин; по оси ординат - (а) диурез (V в мл/мин?100 г массы тела), (б) реабсорбция осмотически свободной воды (ТCН2О в мл/мин?100 г массы тела), (в) очищение от ионов натрия (СNa в мл/мин?100 г массы тела). Стрелка - инъекция в мышцу 0.05 нмоль АВТ или аналогов на 100 г массы тела.