Статья: Интродукционные ресурсы древесных видов как источники биологически активных веществ

Всероссийский НИИ агролесомелиорации

Интродукционные ресурсы древесных видов как источники биологически активных веществ

В.А. Семенютина

Zizyphus jujuba (унаби) на протяжении долгого времени используется в косметике и медицине. Несмотря на это биохимический состав плодов унаби мало изучен. Растущий интерес на биологически активные вещества для нужд медицины, парфюмерии, пищевой промышленности при одновременном истощении традиционных ресурсов заставляет уделять внимание новым нетрадиционным источникам сырья. С этой точки зрения унаби можно рассматривать как перспективный объект, благодаря высокому содержанию углеводов, протеинов, витаминов, пектина, органических кислот [1, 2].

Её родина Китай, где площади промышленных насаждений достигают 200 тыс. га. Унаби широко встречается в Индии, Афганистане и Иране, в Таджикистане и на юге Туркмении и успешно введена в культуру в Ставропольском крае [3]. Морозостойкие сорта Zizyphus jujubа представляют научно-практический интерес для южных районов Нижнего Поволжья.

Рисунок 1 - Схема размещения растений унаби на коллекционном участке

Цель работы - изучить биохимический состав сортов унаби (Zizyphus jujubа Mill.) с учетом их адаптационных возможностей и эколого-хозяйственной перспективы практического применения в засушливых условиях Волгоградской области.

Объектом исследований являлись плоды, косточки, листья коллекции сортов унаби, произрастающей в ФГУП «Волгоградское» ВНИАЛМИ РАСХН. На примере этой коллекции проведена сравнительная оценка адаптационных возможностей и биохимического состава 6 сортов унаби (крупноплодных - Южанин, Та-Ян-Цзао, среднеплодных - Дружба, Финик и мелкоплодных - Темрюкский, Сочинский, рисунок 1).

Условные обозначения: В опыте:

Вариант - Та-Ян-Цзао Общая площадь-1680 м2

- Южанин Площадь питания 6x4 м

- Дружба Повторность 3-кратная

- Темрюкский Всего деревьев-70 шт.

С Сочинский

Почвы участка ФГУП «Волгоградское» характеризуются небольшим количеством гумуса (0,54-0,94 %). Содержание подвижных форм азота, фосфора, калия типично для светло-каштановых почв. Данные анализа водной вытяжки свидетельствуют об отсутствии засоления почвенно-грунтовой толщи (таблица 1).

Таблица 1 - Состав водно-растворимых солей (мг.- экв./%) в светло-каштановой почве коллекционного участка

Рисунок 2 - Коллекция сортов унаби, произрастающая в ФГУП «Волгоградское»

В плодах и ягодах как сумму сахаров, так и раздельно моносахара и сахарозу определяют по Бертрану [4]. Метод основан на способности редуцирующих сахаров, обладающих свободной карбонильной группой, восстанавливать в щелочном растворе окисную медь в закисную. Сахароза и другие олигосахара, у которых связаны обе карбонильные группы, требуют предварительного гидролиза кислотой (НСl) или ферментом. Задача заключается в определении количества образовавшегося осадка закиси меди, которое строго соответствует количеству сахара в растворе. При этом протекают следующие реакции:

CuSO4 + 2NaOH = Cu(OH)2 + Na2SO4

Cu(OH)2 + (CHOHCOO)2NaK = Cu(OCHCOO)2NaK + 2H2O

2Cu(OCHCOO)2NaK + RCOH = Cu2O + 2(CHOHCOO)2NaK + RСООН

Ход анализа

Исследуемый материал (плоды) тщательно моют, обтирают и измельчают на терке. Из хорошо перемешанной мезги берут навеску плодов (25 г.) унаби каждого сорта отдельно заливают 150 мл дистиллированной воды в 250 мл колбе. Добавляют 2-3 капли раствора карбоната натрия и нагревают на водяной бане до 80°С, после чего выдерживают в горячей воде при той же температуре 15 мин. и охлаждают.

После охлаждения приливают 10 мл 15%-ного сульфата цинка (ZnSO4) и 10 мл 10%-ного раствора желтой кровяной соли (K4Fe(CN)63H2O) и доводят до метки дистиллированной водой, после чего фильтруют через складчатый фильтр. Получается фильтрат А, в котором определяют моносахара.

Для определения моносахаров в эрленмейеровскую колбу на 100 мл наливают 5 мл фильтрата А, 20 мл сульфата меди и 20 мл раствора сегнетовой соли, нагревают до кипячения, кипятят 3 мин, затем красному осадку закиси меди дают осесть, а находящуюся сверху жидкость сливают и фильтруют через фильтр Шота. Осторожно промывая горячей дистиллированной водой, фильтр Шота вставляют в колбу Бунзена. Берут 25 мл раствора железо-аммонийных квасцов и наливают понемногу на фильтр, где находится осадок закиси меди. После растворения всей закиси меди (Cu2O) промывают фильтр горячей водой и раствор, собравшийся в колбе, титруют 0,1 Н раствором KMnO4 до появления розового окрашивания. 1 мл 0,1 Н раствора KMnO4 соответствует 6,36 мг Cu.

По таблице Бертрана (зная количество меди, участвовавшее в реакции) находим, сколько было сахара в исследуемом растворе.

1. Находим количество плодов, взятых для определения инвертного сахара по формуле Н?V1чV2, где Н - навеска (масса), V1 - объем фильтрата, V2 - общий объем. Подставляя численные значения, получаем 25?5ч250=0,5 г (плодов).

На титрование раствора при 5 мл фильтрата А израсходовано 45 мл KMnO4. 1 мл 0,1 Н раствора KMnO4 соответствует 6,36 мг Cu;

2. Находим количество восстановленной меди в 5 мл фильтрата А:

45?6,36=286,2 (мг).

Вычисленное количество Cu переводим в соответствующий сахар (содержание которого определяется по табл. Бертрана в %).

Для определения сахарозы 50 мл фильтрата А помещают в мерную колбу на 100 мл, прибавляют 3 мл концентрированной HCl. Колбу нагревают до 68-70?С на водяной бане и выдерживают при этой температуре 8 мин. После этого вытяжку охлаждают до 20?С и доливают водой до метки. Полученный фильтрат будем называть «фильтратом Б». В колбу Эрленмейера на 100 мл (коническая колба) наливают: 20 мл CuSO4, 20 мл сегнетовой соли и 10 мл вытяжки фильтрата Б. Кипятят в течение 3 мин. Далее схема опыта соответствует определению моносахаров. Поправочный коэффициент на сахарозу 0,95. Сумма сахаров складывается из дисахаров и моносахаров.

Определение аскорбиновой кислоты (витамина С)

Метод основан на редуцирующих свойствах аскорбиновой кислоты. Раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола синего цвета (краска Тильманса) восстанавливается в бесцветное соединение экстрактами растений, содержащими аскорбиновую кислоту. Для определения содержания витамина С в плодах и ягодах кислотные вытяжки из них титруют раствором краски Тильманса (определенного титра) до слабо-розового окрашивания, возникающего при избытке краски в кислой среде.

Реактивы, посуда и приборы.

1. 2%-ный раствор метафосфорной или щавелевой кислоты (20 г метафосфорной или щавелевой кислоты растворить в дистиллированной воде до 1 л) и 1%-ный раствор соляной кислоты (23 мл соляной кислоты у.в. 1,19 довести дистиллированной водой до 1 л) смешать в соотношении 4:1.

2. Раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола 0,001н. Растворить 60 мг 2,6-дихлорфенолиндофенола в теплой дистиллированной воде, добавить 4-5 капель 0,01н щелочи. Профильтровать через бумажный фильтр в мерную колбу емк.200 мл, охладить и довести водой до метки. Раствор краски Тильманса готовят перед употреблением, годен до 3 дней, а при хранении в холодильнике - до 7 дней. Перед использованием краски определить точный титр по аскорбиновой кислоте (по Прокошеву) или по соли Мора.

3. Соль Мора - 0,01н раствор (3,92 соли Мора растворить в воде, добавить 0,56 мл H2SO4 у.в. 1,84 и довести до 1 л), хранит в склянке из темного стекла и проверять каждые 3-4 недели по титрованному 0,01н раствору марганцевокислого калия по общим правилам объемного анализа.

Установка титра краски по соли Мора производится следующим образом: отмерить в стаканчик 10 мл раствора краски, добавить 3-5 мл насыщенного раствора щавелевокислого аммония или натрия и титровать солью Мора из микробюретки до перехода синего цвета краски в соломенно-желтый (нерезкий переход цвета, появление бурых тонов свидетельствует о порче краски).

Поправку (F) на титр 2,6-дихлорфенолиндофенола вычисляют по формуле

F = V1?V2/V3 ,где

V1 - количество солим Мора, пошедшее на титрование 10 мл краски;

V2 - количество мл марганцевокислого калия, пошедшего на титрование 10 мл соли Мора;

V3 - количество мл марганцевокислого калия, пошедшего на титрование 10 мл точно 0,01н раствора щавелевой кислоты.

1 мл точно 0,001н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола соответствует 0,088 мг аскорбиновой кислоты. Отсюда вычисляется миллиграмм-титр краски - T=F·0,088, т.е. какому количеству аскорбиновой кислоты соответствует 1 мл краски.

Пример расчета: на 10 мл краски пошло 1,55 мл соли Мора, на 10 мл соли Мора - 9,1 мл KMnO4, на 10 мл 0,01н щавелевой кислоты - 9,8 мл KMnO4.

F = 1,55 ? 9,1/ 9,8 = 1,439 Т = 1,439 ? 0,088 = 0,1267

4. Калий марганцевокислый 0,1н раствор, из которого затем готовится 0,01н раствор путем разбавления. Титр проверяют каждые 3-4 недели по щавелевокислому аммонию, щавелевокислому натрию или щавелевой кислоте.

5. Ацетатный буфер: 50 г уксуснокислого натра растворить в 50 мл дистиллированной воды и добавить равное по объему количество ледяной уксусной кислоты.

6. Ксилол химически чистый (без сернистых соединений). Каждую новую партию ксилола необходимо проверить на наличие редуцирующих краску примесей. Для этого к 10 мл ксилола добавить 0,1-0,2 мл краски, встряхивать в течение одной минуты, дать отстояться до полного разделения фаз ксилол - краска. Слить ксилол и сравнить на ФЭКе с чистым ксилолом для определения перехода краски в ксилол, что свидетельствует о наличии или отсутствии редуцирующих веществ. Переход 0,1 мл краски в ксилол заметен визуально.

При отсутствии ксилола можно использовать другие растворители (хлороформ, четыреххлористый углерод, смесь равных объемов толуола и изобутилового спирта, толуола и н-бутилового спирта, толуола и изоамилового спирта). Однако эти растворители необходимо проверить на наличие редуцирующих веществ и извлечение антоцианов из анализируемого материала.

7. Бюретки на 25 мл или 50 мл для отмеривания буфера, ксилола и краски (3 шт.).

8. Микробюретки с градуировкой 0,01 мл (2 шт.).

9. Колбы мерные или цилиндры емк. 100 мл.

10. Пробирки емк. 25 мл с притертыми пробками, колбочки, воронки, стаканчики.

11. Размельчитель ткани или ступка.

12. Электрофотоколориметр.

13. Центрифуга.

Приготовление вытяжек

При анализе плодов унаби ножом из нержавеющей стали вырезают из возможно большего числа плодов тонкие дольки, доходящие до косточек. Косточковые плоды анализируют без косточек.

Выделенную пробу быстро измельчают ножом, перемешивают и взвешивают 10-20 г в зависимости от содержания витамина С в плодах. Навеску переносят в ступку, заливают 10-2- мл смеси щавелевой (метафосфорной) и соляной кислот и растирают до получения однородной массы, причем навеска все время должна быть покрыта кислотой (растирать не более 10 минут). Для более быстрого растирания плодов с плотной кожицей (смородина, крыжовник) можно добавить небольшое количество (всегда одинаковое) стеклянного порошка. Растертую массу без потерь переносят в мерную колбочку или цилиндр емк.100 мл. Ступку и пестик несколько раз ополаскивают смесью кислот, перемешивают, настаивают 5-10 минут и затем фильтруют через рыхлый бумажный фильтр или вату в сухую колбу. В этом фильтрате определяется аскорбиновая кислота.

Для предохранения витамина С от окисления предпочтительно брать навески непосредственно в ступки, вытарированные с небольшим количеством (20-25 мл) смеси кислот, сразу погружая кусочки плодов в кислоту. биохимический произрастание древесный парфюмерия

При массовых анализах можно использовать размельчитель ткани с ножами из неокисляющегося металла. В этом случае поступают так: навеску 10-20 г перенести в размельчитель ткани, залить 100 мл экстрагента (смесь щавелевой и соляной кислот) и размельчить до гомогенного состояния. Перелить в другую посуду, закрыть пробкой и настаивать 15-20 минут (лучше в темноте). Профильтровать через вату в сухую колбу. Ввиду стойкости аскорбиновой кислоты в присутствии метафосфорной и щавелевой кислот титрование вытяжек можно отложить до изготовления всей серии, однако не более, чем на 2 часа.

Соляная кислота извлекает из растительной ткани как свободную, так и связанную аскорбиновую кислоту. Метафосфорная и щавелевая кислоты извлекают только свободную аскорбиновую кислоту, улучшают её стойкость в экстрактах, кроме того, метафосфорная кислота осаждает белки, что облегчает фильтрование вытяжек.

Пользуясь свойствами соляной и щавелевой (метафосфорной) кислот извлекать разные формы аскорбиновой кислоты, при необходимости можно определять раздельно свободную и связанную аскорбиновую кислоту.

Титрование неокрашенных вытяжек

Пипеткой отмеряют 2-10 мл вытяжки (в зависимости от содержания аскорбиновой кислоты) в стаканчик или колбочку и титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола из микробюретки до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение одной минуты. Титрование трехкратное. Для расчетов берется среднее из трех титрований.