Материал: Физиология бактерий

6

Высокое содержание липидов обусловливает устойчивость некоторых бактерий (например, микобактерий туберкулеза) к спиртам, щелочам, кислотам.

Нуклеиновые кислоты бактерий представлены РНК и ДНК. РНК в основном содержится в рибосомах, ДНК - в нуклеоиде. ДНК является носителем наследственной информации бактерий. Нуклеоид бактерий содержит около 1 тысячи генов. Почти все они кодируют синтез ферментов. Для каждого вида бактерий характерен свой набор ферментов.

Ферменты бактерий и их выявление

Все обменные процессы в бактериальной клетке идут с участием ферментов (энзимов). Ферменты выполняют функцию биокатализаторов. Они представляют собой простые или сложные белки. Принято различать экзоферменты и эндоферменты. Экзоферменты выделяются микробной клеткой во внешнюю среду. Часть экзоферментов связана с питанием бактерий, так как они расщепляют питательные вещества до такой формы, которая способна усваиваться микробной клеткой. Эндо веществ внутри клетки и в

11

Рисунок 3 – Действие экзо- и эндоферментов бактерий.

Одни ферменты синтезируются бактериальной клеткой постоянно (конститутивные ферменты), другие ферменты синтезируются только при контакте с определенным субстратом (индуцибельные ферменты). В частности, конститутивными ферментами являются ферменты гликолиза – ферменты окисления глюкозы (гексокиназа, глюкозоизомераза, альдолаза и др.). Индуцибельными ферментами являются бета-галактозидаза (катализирует расщепление лактозы на глюкозу и галактозу) и бета-лактамаза (расщепляет бета-лактамные антибиотики).

Все ферменты подразделяются на шесть классов:

-оксидоредуктазы;

-трансферазы;

-гидролазы;

7

-лиазы;

-изомеразы;

-лигазы (синтетазы).

Оксидоредуктазы – это ферменты, которые катализируют окислительновосстановительные реакции и встречаются во всех живых клетках. Их основная функция – обеспечение организма энергией в доступной для использования форме. Важнейшими представителями оксидоредуктаз являются дегидрогеназы, оксидазы, пероксидазы, гидроксилазы, оксигеназы, каталаза. При идентификации бактерий в основном используют методы выявления каталазы и цитохромоксидазы.

Каталаза разлагает пероксид водорода на воду и молекулярный кислород. Этот фермент выявляют по микробной суспензии с 1% нанесения раствора перекиси плотной питательной среды (рисунок

Тест на каталазу

•Цитохромоксидаза

катализирует восстановительно- окислительную реакцию - окисляются молекулы

ицитохрома с, восстанавливается кислород.

•Цитохромоксидазу

обнаруживают смачиванием бумажки специальным реактивом (1% спиртовый раствор α-нафтола; 1% водный раствор N-диметил-β-

8

Трансферазы – ферменты, которые катализируют перенос отдельных радикалов (РО3, Н2, СН3), частей молекул или целых атомных группировок от одних соединений к другим. К трансферазам относятся ацетилтрансфераза, фосфотрансфераза, аминотрансфераза, метилтрансфераза. Эти ферменты в повседневной лабораторной практике не определяют.

Гидролазы – ферменты, которые катализируют реакции расщепления и синтеза белков, жиров и углеводов с участием воды. К этому классу ферментов относятся пептидогидролазы или протеазы - ферменты, расщепляющие белки; гидролазы гликозидов или гликозидазы, расщепляющие гликозиды (β- фруктофуранозидаза, α-глюкозидаза, β-галактозидаза); эстеразы, катализирующие расщепление сложных эфиров (липаза, фосфатаза). При идентификации бактерий в первую очередь изучают ферменты, расщепляющие углеводы и белки. Способность бактерий расщеплять углеводы, называется сахаролитической активностью, а способность расщеплять белки – протеолитической активностью. Эти признаки выявляются по конечным продуктам расщепления субстратов после посева изучаемой культуры на специальные питательные среды. При ферментации сахаров выявляют образование кислоты (молочной, уксусной, муравьиной) или кислоты и газа (углекислого газа, водорода), а при распаде белков – образование щелочей, сероводорода, индола, аммиака.

Для выявления гликозидаз используют жидкие или полужидкие среды Гисса. Жидкие среды Гисса представляют собой пептонную воду, содержащую один из углеводов (лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и т. д.) и индикатор Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). Для улавливания образующихся газов в пробирку помещают поплавок (микропробирку вверх дном), который при стерилизации заполняется средой. Исходный цвет среды – соломенножелтый. При расщеплении углевода до кислоты наблюдается только изменение цвета среды на красный, а при образовании еще и газа последний скапливается в

не изменяется (рисунок 6).

изменяется.

Рисунок 6 – Жидкая среда Гисса: а – исходная среда: б – разложение углевода до кислоты: в – разложение углевода до кислоты и газа.

9

Полужидкие среды Гисса содержат 0,2-0,5% МПА, 1% одного из углеводов и индикатор ВР (вводно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды – розово-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а при образовании газа отмечаются разрывы среды или пузырьки газа (рисунок 7).

аб в

Рисунок 7 - Полужидкая среда Гисса: а – исходная среда: б – разложение углевода до кислоты: в – разложение углевода до кислоты и газа.

Каждый вид бактерий ферментирует только определенный спектр углеводов, поэтому в одних пробирках цвет среды меняется, а в других – остается исходным, в результате чего наблюдается “пестрый ряд”. Иными словами, для каждого вида бактерий характерен свой “пестрый ряд”. Это позволяет отличить один вид бактерий от другого.

Протеазы бактерий выявляют при посеве чистой культуры на специальные питательные среды (мясо-пептонный желатин - МПЖ, молочный агар, мясопептонный бульон – МПБ). Результат оценивают по разжижению желатина,

разложению казеина молока вокруг колоний или по конечным продуктам распада

Изучение протеолитических свойств по способности разжижать желатин

•Разные виды бактерий имеют разную форму разжижения желатина; S. aureus – в виде воронки; B. antracis – в виде опрокинутой

бактерии, имеющие фермент коллагеназу

Рисунок 9 – Протеолиз казеина.

21

Конечными продуктами распада белков могут быть индол, сероводород и аммиак. Для обнаружения этих продуктов используют индикаторные бумажки, которые помещают внутрь пробирки между стенкой пробирки и ватно-марлевой пробкой. Индикатором на индол (продукт разложения триптофана) является щавелевая кислота. Пропитанная щавелевой кислотой бумажка при наличии индола меняет белый цвет на розовый. В настоящее время тестирование культур на

Рисунок 10 – Тест на индол с помощью индикаторных полосок (а) и при помощи реактива Ковача (б).

Индикатором на сероводород (продукт разложения серосодержащих аминокислот – цистина, цистеина, метионина) является ацетат свинца. При наличии сероводорода белая бумажка приобретает черный цвет за счет образования сульфита свинца (рисунок 11).