Материал: Ферменты

В данной модели делается важное допущение, что для сохранения симметрии димера обе субъединицы должны находиться в одном и том же конформационном состоянии. То есть, разрешены состояния RR и TT , а состояние RT запрещено.

Рисунок 35 – Модель согласованного механизма аллостерических взаимодействий

Обозначим [R0 ] и [T0 ] – концентрации соответствующих форм, с которыми не связаны молекулы субстрата, и L – константа аллостерического равновесия реакции R ↔T в отсутствии субстрата.

Тогда

L = [T0 ] [R0 ]

или

[T0 ] = L[R0 ].

Сделаем еще одно допущение: пусть субстрат может присоединяться только к R -форме фермента. R -форму, связанную с одной молекулой субстрата обозначим R1 ,а связанную с двумя молекулами субстрата – R2 .

Присоединение каждой молекулы субстрата характеризуется одной и той же микроскопической константой диссоциации KR в реакциях

R0 + S ↔ R1

R1 + S ↔ R2 . 80

Поскольку субстрат может связываться с любым из двух активных центров на R0 и, с другой стороны, отщепляться от любого из двух активных центров на R2 ,то константа диссоциации будет иметь вид

KR = 2[R0 ][S] , [R1]

KR = [R1 ][S] . 2[R2 ]

Определим степень насыщения фермента Y , то есть число активных центров с присоединенными молекулами субстрата, отнесенное к общему числу субстрат-связывающих центров:

В общем случае, если n –число субъединиц в молекуле фермента, то доля Y активных центров занятых субстратом описывается уравнением (без вывода)

Y = L α c (1 + c α)n−1 +α (1 +α)n−1 ,

L (1 + c α)n + (1 +α)n

диссоциации T -формы.

81

Если число оборотов в расчете на один активный центр одинаково для фермент-субстратных комплексов с R1 и R2 , то график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата также будет сигмоидным, поскольку

w =Y wmax

Рассмотрим процесс связывания. В отсутствие субстрата почти все молекулы фермента находятся в T -форме. В примере, показанном на рисунке 36,на 105 молекул в T -форме приходится только одна молекула в R -форме ( K R =10−5 М).

Добавление субстрата сдвигает конформационное равновесие в

сторону образования R -формы, поскольку именно R -форма связывает субстрат. Когда субстрат присоединяется к одному активному центру,

82

второй активный центр должен быть также в R -форме, согласно основному постулату данной модели.

Другими словами, переход от T к R и обратно все субъединицы фермента осуществляют согласованно. Следовательно, по мере добавления субстрата доля молекул фермента в R -форме прогрессивно возрастает, и связывание субстрата происходит кооперативно.

Предложенная модель согласованного механизма объясняет влияние аллостерических ингибиторов и активаторов. Аллостерический ингибитор связывается преимущественно с T -формой, тогда как аллостерический активатор связывается преимущественно с R -формой. Аллостерический ингибитор сдвигает конформационное равновесие R ↔T в сторону T , а аллостерический активатор –в сторону R . Эти эффекты можно выразить

количественно через изменение константы аллостерического равновесия L . Аллостерический ингибитор повышает величину L , тогда как аллостерический активатор понижает ее. Эти эффекты показаны на рисунке 36.Степень насыщения Y при всех значениях [S] снижается в присутствии ингибитора и повышается в присутствии активатора.

Рассмотренное ранее неконкурентное ингибирование можно рассматривать как аллостерическое торможение.

Среди аллостерических взаимодействий различают гомотропные (взаимодействия между идентичными лигандами) и гетеротропные (взаимодействия между различными лигандами).

В рассмотренной модели кооперативное связывание субстрата ферментом представляет собой гомотропный эффект, а влияние активатора или ингибитора – гетеротропный. При согласованном механизме аллостерических взаимодействий гомотропные эффекты всегда положительны (кооперативны), а гетерогенные могут быть и положительными и отрицательными.

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1.Как изменяется ход зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в случае аллостерической регуляции ферментативной активности?

83

2.В чем специфика согласованного механизма аллостерических взаимодействий?

3.Как величина константы аллостерического равновесия влияет на ход зависимости степени насыщения активных центров фермента от концентрации субстрата в модели согласованного механизма аллостерических взаимодействий?

4.В чем отличие гомотропных и гетеротропных аллостерических взаимодействий?

30.ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНЫЙ МЕХАНИЗМ АЛЛОСТЕРИЧЕСКИХ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ

Даниэль Кошланд разработал другую модель –последовательный механизм аллостерических взаимодействий( рисунок 37).

Рисунок 37 – Модель последовательного механизма кооперативного связывания субстратааллостерическим ферментом

Воснову модели Кошланда основу положены три постулата.

1.Каждая субъединица может существовать в одном из двух возможных конформационных состояний( R или T ).

2.Связывание субстрата изменяет форму той субъединицы, к которой он присоединяется. Конформация другой субъединицы при этом существенно не меняется.

3.Конформационные изменения, вызванные связыванием субстрата на одной субъединице, могут увеличивать или уменьшать

сродство к субстрату другой субъединицы той же молекулы фермента.

84

Связывание является кооперативным, если у RT -формы сродство к субстрату выше,чем у TT -формы.

Модель простого последовательного механизма взаимодействия отличается от модели согласованного механизма в нескольких отношениях.

Во-первых, в отсутствие субстрата весь фермент находится в T - форме. Переход от T -формы к R -форме индуцируется присоединением субстрата.

Во-вторых, конформационный переход от T к R в разных субъединицах фермента происходит не согласованно, а последовательно. В модели согласованного механизма, напротив, наличие гибридной формы RT исключается. Модель согласованного механизма исходит из важной роли симметрии во взаимодействии субъединиц в олигомерных белках и потому предполагает ее сохранение при аллостерических переходах.

В-третьих, в случае согласованного механизма гомотропные взаимодействия всегда должны быть положительными, тогда как в случае последовательного механизма они могут быть либо положительными, либо отрицательными. Это зависит от структурных переходов, вызванных присоединением первой молекулы субстрата.

Обе модели используются для описания различных аллостерических белков. Однако существуют аллостерические белки, для описания которых требуются более сложные модели.

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1.В чем специфика последовательного механизма аллостерических взаимодействий?

2.Чем отличается модель простого последовательного механизма взаимодействия от модели согласованного механизма?

31. АВТОИНГИБИРОВАНИЕ СУБСТРАТОМ

Другим средством регуляции скорости ферментативной реакции является торможение реакции при высокой концентрации субстрата, как это имеет место в случае разложения мочевины уреазой (рисунок 38).

85

Рисунок 38 – Автоингибирование субстратом реакции разложения мочевины уреазой: 1 – ожидаемая гиперболическая кривая в отсутствие ингибирования; 2 –экспе- риментальные данные, свидетельствующие о усилении ингибирования при повышенных концентрацияхсубстрата

Механизм этого процесса заключается в том, что связывание данного фермента со второй молекулой субстрата эффективно препятствует осуществлению биокаталитической реакции:

k1 k

E + S←→ES →2 E + P

k−1

k3

ES + S←→ES2 → реакции нет.

k−3

Схематически такая модель автоингибирования реакции при высокой концентрации субстрата представлена на рисунке 39.

Очевидное подобие этого механизма рассмотренной выше схеме рН-

где вместо констант диссоциации для случая ионных форм фермента

используем константы диссоциации моно- и бисубстратных фермент86

wKS′

1

wmax

[S]

Рисунок 40 – Зависимости1 /w от [S] для ферментативной реакции, ингибируемой высокойконцентрацией субстрата

87

Величины KS и wmax определяют из обычной зависимости Лайнуивера-Берка в координатах w1 , [S1] при очень малых концентрациях

рН-регулирования, имеет колоколообразный вид. Максимум колоколообразной кривой находим,приравняв нулю производную

уравнение

[S]2 + KS′[S] + KS KS′ −[S](KS′ + 2[S]) =0

или

KS KS′ −[S]2 = 0 .

Откуда положение максимума кривой

[S]wmax = KS KS′ .

Таким образом, в рассматриваемом механизме автоингибирования (самоторможения) субстратом скорость реакции увеличивается при увеличении концентрации субстрата, но в присутствии избытка субстрата скорость падает, обеспечивая простое средство прямой регуляции скорости образования продукта.

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1.В чем заключается механизм автоингибирования субстратом?

2.Как определяют константу диссоциации KS′ ?

3.Как положение максимума кривой зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата выражается через величины констант диссоциации KS′ и KS ?

88

32. НЕСТАЦИОНАРНАЯ КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

Кинетические исследования ферментативных реакций, протекающих в стационарных условиях, обычно позволяют определить только два параметра: (1)константу Михаэлиса и (2) максимальную скорость реакции.

Для того чтобы зарегистрировать промежуточные "короткоживущие" соединения и измерить константы скорости отдельных стадий необходимо измерить скорость приближения системы к стационарному состоянию. Индивидуальные константы скорости могут быть измерены за промежуток времени, в течение которого устанавливается это состояние.

Характерные времена установления равновесия 1–10–7 с. Для работы в таком предстационарном интервале времен требуется (1) аппаратура для быстрого смешивания и последующего наблюдения за ферментом и субстратом. Кроме того, (2) поскольку наблюдаемые события происходят на самом ферменте, этот фермент должен присутствовать в количествах, сравнимых с количеством субстрата.

В качестве примера рассмотрим схему ферментативной реакции с участием одного промежуточного соединения:

Кинетика данной реакции описывается системой уравнений:

d[ES] = k1[E][S] − (k−1 + k2 )[ES] + k−2 [E][P], dt

w = ddt[P] = k2 [ES] −k−2 [E][P], [E]0 =[E] +[ES],

[S]0 =[S] +[ES] +[P].

Решение этой нелинейной системы уравнений можно существенно упростить, если использовать некоторые условия экспериментального характера, позволяющие привести дифференциальные уравнения к линейному виду.

89