Автореферат: Диагностика и лечение экзогенного аллергического альвеолита

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 23 печатных работы (в том числе 10 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 3 - в зарубежных изданиях), 3 работы приняты к печати (в том числе 2 - в изданиях рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ).

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 235 страницах по традиционному плану, включает введение, обзор литературы, три главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы из 230 источников отечественных и зарубежных авторов. Результаты исследования представлены на 63 рисунках в виде фотографий цитологических, морфологических препаратов и компьютерно-томографических снимков, а так же на 34 таблицах. Иллюстрированы 4 клиническими примерами.

Материалы и методы.

экзогенный аллергический альвеолит лечение

Для решения поставленных задач всего обследовано 298 больных с легочными диссеминациями, находившимися на обследовании и лечении в ФГБУ «ЦНИИТ РАМН» с 2009-2012 годы. У всех пациентов изучался анамнез, проводилось физикальное обследование, обязательный диагностический минимум (ОДМ) принятый в ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН, включающий в себя: клинический и биохимический анализы крови, ЭКГ, анализ мочи, газовый состав крови, функцию внешнего дыхания (ФВД), рентгенографию, компьютерную томографию органов грудной клетки высокого разрешения (КТВР). В обязательном порядке проводилась бронхоскопия со взятием БАЛ и чрезбронхиальной биопсии легочной ткани (ЧБЛ), которые подвергались цитологическому и гистологическому исследованию. В 46 случаях выполнялась диагностическая видеоторакотомия легкого. В результате проведенных диагностических мероприятий из 298 больных ЭАА диагностирован у 105 человек, саркоидоз - у 134, туберкулез - у 32, у 12 пациентов верифицированы полисегментарные пневмонии, у 13 - метастатическое поражение легких, в одном случае диагностирован гранулематоз Вегенера, в одном - инвазивный легочный аспергиллез.

Среди обследованных 105 пациентов с ЭАА женщин - 68 человек (65,4%), мужчин - 37 человек (34,6%) в возрасте от 22 до 76 лет (средний возраст 51,2 1,3 лет). Большая часть пациентов находилась в активном периоде профессиональной деятельности. У всех этих больных объем диагностических методов исследования был расширен. Иммунологическое исследование включало определение в крови больных ЭАА уровня иммуноглобулинов класса А, M, G, а так же уровни преципитирующих антител к различным бытовым, животным и растительным аллергенам с помощью реакции преципитации по Оухтерлони (в модификации А.И.Гусева, В.С. Цветкова, 1968).

Методом проточной цитофлуориметрии проведено исследование образцов венозной крови, где определяли содержание Т-, В-лимфоцитов, НК-клеток, Т-хелперов (CD4), Т-супрессоров (CD8), индекс Тх/Tс (CD4/CD8). Анализ проводили с использованием иммунологического набора Simultest IMK-Lymphocyte («Becton Dickinson», США), на проточном цитометре FACSCalibur с программным обеспечением SimulSET.

Общая клиническая картина выражалась кумулятивным индексом, отражающим интегральную цифровую индексацию выраженности клинических симптомов: одышки, кашля, интоксикации, хрипов или крепитации при аускультации, оцененную в баллах. Для оценки толерантности к физической нагрузке использовался тест 6 минутной ходьбы с регистрацией пройденной дистанции в метрах.

Функцию легких оценивали с помощью спирографии, пневмотахографии, бодиплетизмографии, исследования диффузионной способности легких, газов артериализованной капиллярной крови. В качестве показателей использовали жизненную емкость легких (ЖЕЛ), объем форсированного выдоха за 1 секунду (ОФВ1), максимальные скорости форсированного выдоха при выдохе 25, 50 и 75% (МСВ 25, МСВ50 и МСВ75), газов крови - напряжение кислорода в артериализованной капиллярной крови (РаО2), диффузионную способность легких для окиси углерода методом единичного вдоха (DLCO-SB), коэффициент диффузии (DLCO/VA). Границей нормальных значений считали 80% должной величины.

Компьютерную томографию (КТВР) выполняли в условиях высокого разрешения на 16 рядном мультисрезовом компьютерном томографе Siemens Somatom Emotion в положении больного лежа на спине, на высоте глубокого задержанного вдоха. При анализе полученных данных и количественной их оценки использовали шкалу в модификации Kazerooni et al. (1998). Учитывался альвеолярный компонент по занимаемой площади симптома «матового стекла»и диссеминации, а так же распространенность интерстициального компонента по признаку «сотового легкого» и утолщению межлобулярных септ. Оба из указанных компонента определялись по 5 бальной шкале.

После визуальной оценки состояния слизистой оболочки бронхов получали ЧБЛ, которую использовали для традиционного гистологического изучения легочной ткани. Во время бронхоскопии проводили диагностический БАЛ, который затем подвергался цитологическому, цитофлюориметрическому, электронномикроскопическому исследованию. Эндопульмональную цитограмму определяли на основании подсчета не менее 500 клеток с использованием иммерсионного объектива. При этом учитывали: АМ (альвеолярные макрофаги), Л (лейкоциты), Э (эозинофилы), Т (тучные клетки), Н (нейтрофилы). В этом же материале определяли макрофагальную формулу (МФ) БАЛ, для чего подсчитывали 200 макрофагов и определяли относительное процентное содержание молодых и зрелых клеток с разным фенотипом (Лепеха Л.Н., 1995; 2000; Николаева Г.М., 2004). Для определения значений нормальных показателей использовали материал от 8 здоровых добровольцев. Ультраструктурные особенности АМ и других клеточных элементов БАЛ изучены с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ), для чего клеточный осадок лаважа подготавливали известными методами (Лепеха Л.Н., 1995). Ультратонкие срезы просматривали в электронном микроскопе (увел.100В). Количественный анализ лимфоидных элементов БАЛ проводили на проточном цитометре FACSCaliber с программным обеспечением Cell Qwest с использованием прижизненной иммунологической окраски клеток антителами и флуоресцентными красителями по следующим параметрам: количество жизнеспособных и гибнущих клеток, уровень некроза и апоптоза, а так же индекс CD4/CD8.

Для выявления Candida albicans и Aspergillus fumigatus в материале БАЛ в рамках исследования был использован современный молекулярно-генетический подход. Для исследований выбраны видоспецифичные ПЦР тест-системы разрешенные МЗСР РФ для диагностики.

Амплификацию образцов ДНК проводили в термоциклере Real-time IQ5 (BioRad) для тест-системы с праймерами и зондами для ПЦР в режиме реального времени для Candida albicans, и в амплификаторе Терцик (ДНК-технология) для ПЦР тест-системы с детекцией методом электрофореза для Aspergillus fumigatus.

Полученные данные статистически обработаны при помощи программы Statistica с использованием непараметрических методов. Достоверность различий оценивали с помощью критерия Вилкоксона. Группы пациентов менее 10 человек не подвергались процентному исчислению согласно правилам медицинской статистики.

Результаты исследования

Диагностика различных вариантов ЭАА.

Острый вариант выявлен у 30 (28,6 %) больных ЭАА, 15 мужчин и 15 женщин, в возрасте от 23 до 73 лет (средний 45,5 ± 2,4). Большая часть пациентов - 39,6% - имела контакт с плесневыми грибами, примечательно, что почти у всех этих пациентов была выявлена ДНК указанных грибов методом ПЦР в БАЛ. По клиническому течению данный вариант ЭАА напоминал ОРВИ или пневмонию с преобладанием симптомов интоксикации, развивался быстро от нескольких суток до 1 месяца, имел бурное начало с высокой температурой тела и сухим приступообразным кашлем (у 60% больных). Одышка выражена слабо (не выше 1 степени), и отмечена в 46,6% случаев. У преобладающего большинства больных определяли нарушения газообменной функции легких (в виде снижения РaО2 и DLCO) и нарушения бронхиальной проходимости. Однако, их выраженность оставалась небольшой (не ниже 60% д.в.).

У 56% пациентов отмечено увеличение в крови IgG, а IgM у всех больных с острым вариантом ЭАА. Высокий (1:8 и выше) или средний (1:4) уровень сенсибилизации при определении преципитирующих антител зарегистрирован у 80% больных, что отмечалось только при этом варианте ЭАА, особенно к грибам рода Candida и/или Aspergillus. В периферической крови у 40% больных выявлена умеренная эозинофилия. У всех больных достоверно было повышено соотношение CD4/CD8 (рис.1) и содержание НК-клеток (рис.2)

Рисунок 1 Сравнительная оценка величины индекса CD4/CD8 в крови больных с разными вариантами ЭАА

Рисунок 2 Среднее содержание НК-клеток в крови больных с разными вариантами ЭАА (% от общего числа лимфоцитов)

При анализе КТВР картины больных с острым ЭАА, изменения в легких определены в 100% случаев и представляли собой хорошо известный в литературе симптом «матового стекла» (Прокоп М., 2009; Тюрин И.С., 2008 и др.). Согласно нашим данным, кроме того, у 30% больных наблюдались локальные утолщения междольковых перегородок в пределах одной доли. Изменения, выявленные на КТ, коррелировали с данными гистологического исследования легочной ткани. Утолщение межальвеолярных перегородок большей части легочной паренхимы происходит за счет полнокровия капиллярной сети, интерстициального отека и обильной инфильтрации мононуклеарами, преимущественно лимфоцитами и плазматическими клетками. Из-за высокой проницаемости микроциркуляторного русла происходит выход во внутриальвеолярное пространство клеточных элементов воспаления и крови. По ходу терминальных воздухоносных путей и сопровождающих их артерий лежат обильные лимфоидно-макрофагальные инфильтраты, характерные для бронхиолита - важного диагностического признака ЭАА (Черняев А.Л., Самсонова М.В., 2011; Чучалин А.Г., 2007).

Приток в респираторный отдел лимфоцитов хорошо отражает цитограмма БАЛ, где они составляют 63,86±3,23%. Среди лимфоцитов много зрелых плазматических клеток. Кроме того, определяются все типы гранулоцитов, в том числе нейтрофилы, что имеет важную диагностическую ценность для данного варианта ЭАА (табл.1).

Таблица 1

Особенности эндопульмональной цитограммы БАЛ при разном течении ЭАА

Разница достоверна по сравнению с контролем: * - p < 0,05 , ^** - p < 0,01.

Характерно, что при остром варианте ЭАА величина индекса СД4/СД8 больше 1 (табл.2), что так же составляет характерную особенность этой группы больных.

Таблица 2

Сравнительная характеристика величины индекса CD4/CD8 при различных вариантах ЭАА

Разница достоверна по сравнению с острым вариантом заболевания: * - p < 0,05 , ^** - p < 0,01.

Еще одним диагностическим признаком острого ЭАА является повышенное число в составе МФ молодых неактивированных мононуклеаров и зрелых АМ (табл.3), в фагосомах которых, методом световой и электронной микроскопии определены фрагменты ПЯЛ и лимфоцитов. Последние подвергаются некрозу (15-17%), тогда как апоптозные лимфоциты у этой группы составляют только 2-8%.

Таблица 3

Особенности макрофагальной формулы БАЛ при разном течении ЭАА

Разница достоверна по сравнению с контролем: * - p < 0,05 , ^** - p < 0,01.

Подострый вариант диагностирован у 43 (41%) больных ЭАА, 14 мужчин и 29 женщин в возрасте от 22 до 73 лет (средний возраст 49,0±2,0). Длительность заболевания колеблется от 1 месяца до 1 года. В большинстве случаев (72,1%) больные с данным вариантом заболевания имели контакт с аллергенами животного происхождения. В клинической картине доминировали сухой кашель и одышка, которая регистрировалась у 81,4% больных и документировалась 2 степенью более чем у половины пациентов. Жалоб на наличие признаков интоксикации у пациентов с подострым течением заболевания, в отличие от острого, зафиксировано не было.

У 29,4% больных в крови отмечено повышение уровня IgG, а у 64,7% значения IgA. Преципитирующие антитела к шерсти различных животных, перьям и экскрементам птиц определены менее, чем у трети больных (27,9%), при этом уровень сенсебилизации, как правило, имел средние значения (1:4). Примечательно, что эти данные зачастую не совпадали с анамнестическими. В гемограмме наблюдалась ускоренная СОЭ почти у половины больных (48,8%), реже - увеличение общего количества лейкоцитов (в 25,6% случаев) и эозинофилов (в 34,8% случаев). При цитофлюориметрическом исследовании крови у лиц с подострым вариантом ЭАА зарегистрировано повышение уровня НК- клеток, Т и особенно В-лимфоцитов (до 17,2%) (рис.3), сочетающееся с нормальными значениями индекса CD4/CD8 (см. рис.2).