Дипломная (вкр): Біосинтез антибіотика доксорубіцину

Враховуючи, що час культивування в інокуляторі 2, посівному апараті та ферментері значний (по 148 год), то стерилізацію поживного середовища для них проводимо в окремих збірниках. Середовище пропонується поділити на композиції. Композиції будуть наступні:

Композиція 1. декстроза, пивні дріжджі.

Композиція 2. NaCl, КН2РО4, MgSО4, FeSО4 7H2О, ZnSО4 7H2О.

Композиція 3. CaCO3.

На першому етапі для вирощування посівного матеріалу в колбах потрібно 5 л поживного середовища. Тому для стерилізації компонентів обираємо автоклав з вертикальним завантаженням Systec VX <#"896748.files/image005.gif">= 30 хв

КУО < 1

К6.2. Технологічний та мікробіоло-гічний контроль вирощування посівного матеріалу в І інокуляторі.             Температура Час рН Концентрація біомаси     рН-метр, Термометр Годинник   Під час вирощування посівного матеріалу в інокуляторі   рН =7,2, τ = 24 год,= 30 ˚С

Х = 4,5 г/л

КУО ст. м. < 1

К6.3. Технологічний та мікробіоло-гічний контроль вирощування посівного матеріалу в ІІ інокуляторі.           Температура Час рН Концентрація біомаси     рН-метр, Термометр Годинник   Під час вирощування посівного матеріалу в інокуляторі   рН =7,2, τ = 24 год,= 30 ˚С

К6.4. Технологічний та мікробіоло-гічний конт-роль вирощу-вання посівно-го матеріалу в ІІІ інокуляторі      Температура Час рН Концентрація біомаси     рН-метр, Термометр Годинник   Під час вирощування посівного матеріалу в інокуляторі   рН =7,2, τ = 24 год,= 30 ˚С

Х = 4,5 г/л

К6.5. Технологічний та мікробіоло-гічний конт-роль вирощу-вання посівно-го матеріалу в посівному апараті               Температура Час рН Концентрація біомаси      рН-метр, Термометр Годинник   Під час вирощування посівного матеріалу в посівному апараті рН =7,2, τ = 24 год,= 30 ˚С

Х = 4,5 г/л

КУО ст. м. < 1

К7.1., К7.2.,  К7.3., Технологічний та мікробіоло-гічний контроль при виробничому культивуванні.  Температура Час рН Концентрація біомаси     рН-метр, Термометр Годинник   Під час вирощування посівного матеріалу в ферментері    рН =7,2, τ = 72 год,= 30 ˚С

Х = 6 г/л

.2 Мікробіологічний контроль

Визначення концентрації біомаси

Концентрацію біомаси визначаємо за оптичною густиною клітинної суспензії із наступним перерахунком на абсолютно суху біомасу у відповідності з калібрувальним графіком.

Культуральна рідина розводиться дистильованою водою у співвідношенні 1:9. Суміш збовтується, потім вимірюється оптична густина (при 540 нм), отримані дані перераховують за калібрувальним графіком [3].

Визначення концентрації цільового продукту

Концентрацію цільової речовини визначають методом обернено-фазової рідинної хроматографії високого тиску.

Використовується колонка (4,6 х 250 мм, 5 мкм розмір часточок) зі швидкістю потоку 0,385 мл/хв. Рухома фаза А водний 0,2 % розчин трифтороцтової кислоти, а рухома фаза В - 0,078% розчин три хлороцтової кислоти в ацетонітрилі. Елюцію проводять за лінійним градієнтом від 20 до 60% фази В по фазі на 33 хв. Контролюють за допомогою діодного множинного детектора, встановленого на 488 нм. Доксорубіцин концентрацією 10 мкг/мл розчинений в метанолі використовують в якості стандарту для визначення кількості цього метаболіту в ізольованих культурах [27].

Визначення концентрації джерела вуглецю

Суть методу визначення концентрації джерела вуглецю полягає в утворенні Cu(OH)2, при змішуванні робочих розчинів Фелінга І та Фелінга ІІ, який легко відновлюється до вільної міді альдегідної групи глюкози. Мідь, яка виділяється, відновлює KI до вільного йоду, який відтитровують тіосульфатом натрію. Як індикатор використовується крохмаль.

Для культивування S. peucetius використовується поживне середовище джерелом вуглецю в якому є декстроза. Перед початком висначення декстроза гідролізується за допомогою 5 % розчину соляної кислоти 30 хв, при температурі 40 °С. По закінченню гідролізу суміш нейтралізують розчином гідроокису натрію до рН 7,0.

Для визначення глюкози, в колбу вноситься 5 - 9 мл розчину, що досліджується і доводиться дистильованою водою до загального об’єму 10 мл.

Додають по 10 мл розчину Фелінга І і Фелінга ІІ. Колбу ставлять на нагрівник та кип’ятять 2 хвилини. Після охолодження додають 15 - 20 мл 20 % сірчаної кислоти і 3 г йодистого калію. Виділений йод титрують 0,1 н розчином тіосульфату. Коли розчин йоду починає світлішати, додають 2 - 3 краплини крохмалю і продовжують титрувати до зникнення синього забарвлення і виділення синього осаду. Кількість міді, яка пішла на реакцію з глюкозою, визначають за формулою:

Сu = ((a − b) × k × 6,36) / C, де

а - кількість 0,1 н розчину тіосульфату, яка пішла на титрування досліджуваного розчину, мл;- кількість 0,1 н розчину тіосульфату, яка пішла на титрування контрольного розчину, мл;- поправочний коефіцієнт, k = 1;

,36 - кількість мл Cu, яка відповідає 1 мл 0,1 н тіосульфату;

С - кількість досліджуваного розчину, яка пішла на титр, мл.

Визначення азоту амінних груп методом формольного титрування

Методи кількісного визначення амінокислот досить різноманітні і чисельні. У деяких випадках необхідно визначити сумарну кількість усіх амінокислот у гідролізаті білків, або в екстрактах з біологічного матеріалу.

Один із таких методів, заснований на визначенні азоту амінних груп, був запропонований Сьоренсеном.

За зміною вмісту амінного азоту можна судити про швидкість гідролізу білка, дії протеолітичних ферментів, швидкість перетворення білків та амінокислот у тканинах організму.

Під час гідролізу білка внаслідок розриву пептидних зв'язків у розчині відбувається збільшення вільних аміно- і карбоксильних груп. Амінокислоти у водних розчинах утворюють внутрішньо молекулярні солі, тому без попереднього блокування аміногруп безпосередньо титрувати лугом карбоксильні групи неможливо.

Принцип методу грунтується на здатності формальдегіду зв’язувати вільні аміногрупи з утворенням метиленових похідних амінокислот. Аміногрупи при цьому втрачають основні властивості, а вільні карбоксильні групи відтитровують розчином лугу.

Існує кілька модифікацій методу формольного титрування, в основі яких лежать наведені реакції.

Матеріали та реактиви: 1. 0,25%-й розчин гліцину або гідролізат білка; 2. 0,1%-спиртовий розчин фенолфталеїну; 3. 0,1 н. розчин гідроксиду натрію; 4. Формольна суміш (до 6 мл 20%-го розчину формальдегіду додають краплину фенолфталеїну і краплинами 0,1 н. розчин гідроксиду натрію до почервоніння рідини. Суміш готують перед початком роботи).

Хід роботи. У колбу на 25 мл наливають 3 мл 0,25%-го розчину амінокислот (наприклад, гліцину) або гідролізату білка; додають краплину 0,1%-го спиртового розчину фенолфталеїну і краплинами 0,1 н. розчин їдкого натру до почервоніння рідини. У нейтралізований таким чином гліцин доливають 2 мл формольної суміші. При цьому червоне забарвлення розчину зникає. Далі титрують 0,1 н. розчином гідроксиду натрію до появи червоного забарвлення.

Мікробіологічний контроль

В першу чергу, перевірка чистоти культуральної рідини проводиться з використанням методу мікроскопіювання, результати методу будуть позитивними, якщо виявленими будуть лише колонії S. peucetius. Проте не завжди вдається отримати точні результати за даним аналізом, оскільки деякі мікроорганізми мають дуже малі розміри. Тому наступною стадією є виділення ізольованих колоній на чашках Петрі з м'ясо-пептонним агаром (МПА − для бактерій) та сусло-агаром (СА − для грибів і дріжджів).

Частота перевірки стерильності культуральної рідини приблизно кожні 5 години. Після інкубації посівів на середовищах МПА не повинен бути виявлений ріст контамінуючої мікрофлори [2].

ЛІТЕРАТУРА

Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. - Москва, «Химия» - «Колос», 2004 г. - 296 с.

Буценко Л. М., Пенчук Ю.М., Пирог Т.П. Технології мікробного синтезу лікарських засобів: Навч. посіб. - К.: НУХТ, 2010. - 323c.

Валагурова Е. В., Козырицкая В.Е. Актиномицеты рода Streptomyces. Описание видов, их идентификация. - К.: Наукова думка, 2003. - 647c.

Гордєєва Ю. Л., Івашкін Ю. А., Гордєєв Л. С. Алгоритми розрахунку показників процесу мікробіологічного синтезу в періодичних умовах культивування // Вісник Астрахан. держ. техн. ун-та. Сер: Управління, обчислювальна техніка та інформатика. - 2011. - № 2. - С. 7-14.

Дубицька Л. П., Федоренко В.О. Характеристика мутантів Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC 27952, cтійких до антрациклінових антибіотиків // Мікробіол. журн. - 2001. - С. 53-61.

Дубицька Л.П., Федоренко В.О. Характеристика мутантів Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC27952-2, cтійких до хлорамфеніколу // Вісн. Львів. ун-ту. - 2002. - С.105-113.

Дудниченко А.С. Новые возможности в лечении рака // Провизор.- 2000. - C 32 - 39.

Егоров Н.С. Биотехнология: проблемы и перспективы. - М.: Высшая школа, 1997. - 208 c.

Коломбо А. Л, Хатчинсон. Генная инженерия доксорубицина производства в Streptomyces peucetius // Microbiol. Biotechnol. J. - 1999. - P. 29 - 41.

Леонтьева О. В. Взаимодействие новых полусинтетических производных антрациклиновых антибиотиков с чувствительными и резистентными опухолевыми клетками in vitro. Автореф. дис. кандидат биологич. наук. - Москва, 1995. - C. 44 - 50.

Малежик І. Процеси та апарати харчових виробництв. - К.: НУХТ, 2003. - с. 400.

Мацелюх А. Б. Стрептоміцети - продуценти антибіотиків // Мікробіол. журнал. - 2003. - 214 с.

Никитин А. В. Антибиотики и макроорганизм// Антибиотики и химиотерапия. - 2000. - № 12. - С. 31-36.

Новіков В., Сидоров Ю., Швед О. Тенденції розвитку комерційної біотехнології. // Вісн. НАН України. - 2008. - 459 c.

Пат. 2205222 USA, МПК 7 C12P19/56. Способ получения доксорубицина и средства для его осуществления / Бреме Умберто // заявл. 20.05.1999. опубл. 27.05.2003.

Пирог Т.П., Ігнатова О.А. Загальна біотехнологія. - К.: НУХТ, 2009. - 314 с.

Федоренко В.О.; НАН України. Ін-т клітин. біології та генет. інженерії. Автореф. дис... д-ра біол. наук: 03.00.15- К., 2004. - 32 с.S., Maffioli S., Monciardini P. Antibiotic discovery in the 21st century: current trends and future perspectives // J. Antibiotics. - 2010. - P. 2 - 15.J., Farge D., Ponsinet G. Daunorubicin derivatives. USA, 2001Moo J., Marimuthu J., Sang-Uong Kim et al. Biosynthesis, biotechnological production and application of teicoplanin: current state and perspectives // Appl. Microbiol. Biotechnol, - 2009. - P. 16 - 30.

Kiviharju <http://link.springer.com/article/10.1007/s10295-004-0172-3/fulltext.html> С., Leisola М. і Eerikаinen T. Optimization of Streptomyces peucetius var. caesius N47 cultivation and ε-rhodomycinone production using experimental designs and response surface methods // J. of Ind. Microbiol. and Biotechnol. - 2004. - P. 24 - 28.R., Rebets Y., Ostash B. et al. Genetics factors that influence moenomycin production in Streptomycetes // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. - 2010. - P. 46 - 49.Sailesh <http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1389172309001406> Self-resistance mechanism in Streptomyces peucetius: overexpression of drrA, drrB and drrC for doxorubicin enhancement // Microbiol. Research http://www.sciencedirect.com/science/journal/13891723 - 2009. - P. 259-267.

Mayra K. M. Antibiotics produced by Streptomyces // Braz. journal of infectious. - 2012. - P. 12 - 21.P., Padmanabhan S., Sankara N.. Regulation of Daunorubicin production in Streptomyces peucetius // J. of Bacteriol. - 2010. - Р. 30 - 38.<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Scotti%20C%5Bauth%5D> C.,  Hutchinson <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hutchinson%20CR%5Bauth%5D> C. Enhanced antibiotic production by manipulation of the Streptomyces peucetius dnrH and dnmT genes involved in doxorubicin (adriamycin) biosynthesis // J. Bacteriol. - 1996. - Р. 48 - 56.of doxorubicin production by expression of structural sugar biosynthesis and glycosyltransferase genes in S. peucetius [електронний ресурс] www.science direct.com /science / article / pii /S1389172309001406 , 14-hydroxydaimomycin, a new antitumor antibiotic from S. рeucetius var. Caesius [електронний ресурс] www.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ bit.260110607/abstract