Дипломная (вкр): Біосинтез антибіотика доксорубіцину

Біосинтез антибіотика доксорубіцину

РЕФЕРАТ

Проект присвячено вивченню процесу біосинтезу антибіотика доксорубіцину, продуцентом якого є актиноміцет Streptomyces peucetius. Складається зі вступу, п‘яти розділів, графічних матеріалів та списку використаної літератури.

Дипломний проект викладений на ___ сторінках друкованого тексту, містить 7 таблиць, 5 рисунків.

Основними положеннями в даній роботі є вибір та характеристика біологічного агента - продуцента антибіотику, характеристика кінцевої продукції виробництва, підбір обладнання для ферментаційних та після ферментаційних процесів

У роботі дано обґрунтування та викладено технологічний процес ділянки біосинтезу виробництва препарату, який включає блок допоміжних робіт і стадії вирощування культури.

Ключові слова: Streptomyces peucetius, доксорубіцин, антрацикліновий антибіотик, протипухлинний антибіотик, поживні середовища, біосинтез, культуральна рідина.

ВСТУП

біосинтез антибіотик культивування

Розробка протипухлинних лікарських засобів є пріоритетним напрямком біотехнологічних досліджень в світі. Близько 60 % розроблюваних біотехнологічних засобів призначені для лікування раку або захворювань, пов'язаних з ним. Японія займає друге місце в світі після США. Поряд із США та Японією біотехнологія швидкими темпами розвивається і в країнах Західної Європи. За оцінкою Interpharm Press, скоординувавши свою діяльність, ці країни можуть в майбутньому зробити значний вплив на кон'юнктуру ринку біотехнологічних продуктів [8].

В Україна нині не приділяється належна увага формуванню ринку біотехнологічної продукції. Тому сучасний стан галузі характеризується наявністю науково-технологічного потенціалу і відсутністю структури, яка б сприяла широкому впровадженню біотехнологічних розробок [16].

Однією з вимог до проектування біотехнологічного виробництва є економічна доцільність вибору типового обладнання. Найважливішою стадією в проектуванні біотехнології є стадія біосинтезу. Отже ферментаційні системи та обладнання - одна з основних складових біотехнологічного процесу, як по складності реалізації, так і за впливом на рентабельність виробництва. Існуючі методи розрахунку і прогнозування змін технологічних параметрів ферментації досі залишаються недосконалими. Тому слід проводити роботи з удосконалення обчислювальних алгоритмів з метою оптимізації періодичних процесів мікробного синтезу [4].

Утворення антибіотиків - це спадково закріплена особливість метаболізму організмів [32]. Це специфічна особливість виду або штаму мікроорганізмів, яка виникла в результаті еволюційного розвитку як одна з пристосувальних особливостей щодо проявлення антагоністичних відносин, що дуже розповсюджені в світі мікроорганізмів [14].

Природні мікроорганізми, як правило, володіють низькою продуктивністю тих речовин, виробництво яких необхідно. Для біотехнології потрібні високопродуктивні штами мікроорганізмів. Їх створюють методами селекції - спрямованого відбору спонтанних або індукованих мутантів. У результаті селекції продуктивність продуцентів вдається збільшити в сотні або тисячі разів.

Одним з найбільш успішних і економічно вигідних напрямків мікробіологічної промисловості є виробництво медичних препаратів. Зазвичай вони ефективні у відносно малих кількостях і мають досить високу вартість. Отримання їх в ферментерах дозволяє знизити собівартість. Тому є доцільним розглядати найбільш ефективні методи отримання медичних препаратів [2].

Актуальність. Доксорубіцин відноситься до класу речовин, які володіють не тільки протимікробною, але і протипухлинною активністю [7]. Одним з важливих та перспективних завдань вітчизняної біотехнології є виробництво ефективних протипухлинних антибіотиків. Їх потреба в Україні висока у зв'язку із постійним зростанням числа онкологічних захворювань. Дані препарати активно використовуються при лікуванні злоякісних пухлин різного походження, таких як: різних гематологічних видах раку, саркомах м'яких тканин, карцинома тощо [22].

Новизна. Пропонується використовувати рекомбінантний штамів Streptomyces peucetius ATCC 27952, що володіє зниженою чутливістю до наявності продукованого ними доксорубіцину в середовищі. Це дозволяє збільшити вихід продукту більше, ніж у 2 рази (з 2,1 мг/л до 5 мг/л). Для біосинтезу доксорубіцину, в даному проекті використовується поживне середовище, яке за собівартістю є дешевшим ніж середовища, які зазвичай використовуються [27].

РОЗДІЛ 1. ХАРАКТЕРИСТИКА КІНЦЕВОЇ ПРОДУКЦІЇ ВИРОБНИЦТВА

Доксорубіцин (лат. Doxorubicinum, англ. Doxorubicin) - один з антрациклінових антибіотиків, що продукується штамами Streptomyces coeruieorubidus або Streptomyces peucetius. У 1969 році DXR вперше був виділений із S. peucetius var. Caesius ATCC 27952, мутантний штам, отриманий із S. peucetius ATCC 29050 [6].

Антрацикліновий антибіотик доксорубіцин володіє високою протипухлинною і протилейкозною активністю при низькій вибірковості дії. утворюється C-14 гідроксилюванням його безпосереднього попередника даунорубіцину, а також виконує свою антипроліферативну дію на ракові клітини за допомогою двох різних механізмів: інтеркаляції та інгібування ферменту. Обидва ці механізми спричиняють руйнування ДНК, що в кінцевому результаті призводить до загибелі клітин [12].

Механізм цитотоксичної дії антибіотика пов'язаний, головним чином, з інгібуванням синтезу нуклеїнових кислот (ДНК та РНК) шляхом інтеркаляції між парами азотистих основ, порушенням вторинної спіралізації ДНК за рахунок взаємодії з топоізомеразою II, а також зв'язуванням з ліпідами клітинних мембран, що супроводжується зміною транспорту іонів і клітинних функцій [26].

Після введення доксорубіцин швидко розподіляється в плазмі та в тканинах. Вже через 30 с препарат виявляється в печінці, легенях, серці та нирках. Він не проникає крізь гемато-енцефалічний бар'єр, однак є проникним через плацентарний бар'єр і виявляється в грудному молоці.

Період напіввиведення доксорубіцину та його метаболіту становить від 20 до 48 год [34].

Доксорубіцину гідрохлорид є кристалічний або аморфний порошок оранжево-червоного або червоного кольору. Гігроскопічний, розчинний у водних розчинах кислот, бутанолі, хлороформі, важкорозчинний в метанолі та ацетоні, у воді розчинність становить 2600 мг /л при 25 ° С. Водні розчини мають жовто-помаранчевий колір при кислотному рН, оранжево-червоний при нейтральному рН, і фіолетово-синій при рН > 9. Водні розчини залишаються незмінними після зберігання протягом місяця при 5° С , але нестабільні при високих температурах або при кислій або лужній реакції середовища. рН 4,0-5,5.

Температура плавлення: 205° С з розкладанням [33].

Молекулярна маса: 580 [33].

Формула: C27H29N O11 [33].

Назва за ІЮПАК: (8S-цис)-10(3-аміно-2,3,6-тридезокси-альфа-L-ліксогексо-піранозил)окси-7,8,9,10-тетра-гідро-6,8,11-тригідрокси-8-(гиіроксил-ацетил)-1-метокси-5,12-нафтацендіон [33].

Належить до полікетидних продуктів ІІ типу. Молекула доксорубіцина складається з тетрациклічного антрахіноїдного аглікона доксорубіцинона, з’єднаного глікозидним зв'язком з аміноцукром даунозаміном (рис. 1.1)[19].

Рис. 1.1. Структурна формула молекули доксорубіцина

Застосовується для лікування гострого лімфобластного і мієлобластного лейкозу; злоякісної лімфоми ходжкинського і неходжкинського типу; раку молочної залози, легень, сечового міхура, щитовидної залози, яєчників; остеогенної саркоми; саркоми м'яких тканин; саркоми Юінга; нейробластоми; пухлин Вільмса [35].

Пригнічує кровотворення, має імуносупресивну і кардіотоксичну дію. Летальна доза для щурів при підшкірному введенні LD 50 = 21800 мкг / кг. Може викликати віддалені ефекти у вигляді розвитку вторинних злоякісних пухлин (ризик підвищується при тривалому вживанні). Виявляє канцерогенну дію у тварин і потенційно канцерогенний для людини. Але доксорубіцином було проявлено кращу активність, ніж даунорубіцин проти пухлин у мишей. Впливає на статеву функцію, але у людини це дія слабкіша, ніж дія, що виявляється в дослідах на мишах [28]. У експериментах на тваринах проявляє ембріотоксичний і тератогенний ефект.

Однією з характерних токсикологічних особливостей доксорубіцину є кардіотоксичність. Оскільки прояв кардіотоксичної дії залежить від дози і різко підвищується при високих кумулятивних дозах, протипухлинну активність доксорубіцина не можна реалізувати повністю. Включення цитостатика в ліпосоми дозволяє оптимізувати протипухлинний ефект.

При одночасному вживанні з циклоспорином спостерігається підвищення концентрації доксорубіцина в плазмі і посилення мієлотоксичної дії; з циклофосфамідом, мітоміцином, дактіноміцином - можливе посилення кардіотоксичної дії доксорубіцина. При вживанні доксорубіцина (протягом 3 діб) в комбінації з цитарабіном (у вигляді інфузії протягом 7 днів) описані випадки розвитку некротичного коліту і важких інфекційних ускладнень. Доксорубіцин несумісний з розчином гепарину (поява осаду) [35].

Фармакодинаміка. Доксорубіцин чинить виражену протипухлинну і протилейкозну дію. Препарат швидко проникає в клітини, зв’язується з пери нуклеїновим хроматином, пригнічує поділ клітин та синтез нуклеїнових кислот, виявляючи специфічну дію на фазу S поділу клітин, спричиняючи хромосомні аберації.

Фармакокінетика. Після внутрівенного введення Доксорубіцин швидко розподіляється в плазмі та тканинах - вже через 30 с препарат виявляється в печінці, легенях, серці та нирках. Об’єм розподілу в рівноважному стані становить 20 - 30 л/кг. Протягом години після введення Доксорубіцин частково метаболізується в печінці в активний метаболіт. Не проникає крізь ГЕБ. Період напів виведення для Доксорубіцину та його метаболіту становить від 20 до 48 годин. Виводиться з жовчю в незміненому вигляді (приблизно 40 % протягом 5 днів) та нирками в незміненому вигляді та у вигляді метаболітів (майже 5 - 12 % протягом 5 днів).

Показання: гострий лімфобластний та мієлобластний лейкоз, хронічні лейкози, лімфогранулематоз (хвороба Ходжкіна), неходжкінська лімфома, множинна мієлома, остеосаркома, саркома Юінга, саркома м’яких тканин, нейробластома, рабдоміосаркома, пухлина Вільмса, рак молочної залози, рак ендометрія, яєчників, передміхурової залози, легень, шлунка, щитовидної залози, несеміноматозного раку яєчок, перехідного раку сечового міхура.

РОЗДІЛ 2. ХАРАКТЕРИСТИКА БІОЛОГІЧНОГО АГЕНТА

2.1 Обґрунтування вибору біологічного агента

Бактерії Streptomyces peucetius var. сaesius (штами S. peucetius АТСС 29050, S. peucetius var. caesius АТСС 27952) є продуцентами доксорубіцину, який використовується в якості протипухлинного засобу [5].

Бактеріальні штами, виділені з природи зазвичай виробляють лише дискретні кількості вторинних метаболітів На основі біосинтетичних досліджень і аналізу кінцевого продукту, різних чинників, що впливають на його виробництво штамом S. peucetius ATCC 27952, розглядається, щоб уникнути недоліків у виробництві DXR, тим самим забезпечуючи ідеї генної інженерії промислових штамів S. peucetius [10]. Тому проводилися дослідження у клонуванні генів стійкості S. peucetius АТСС 27952 до доксорубіцину. Останні 3 реакції біосинтезу кінцевого продукту каталізуються одним ферментом, активність якого знижується з підвищенням концентрації антибіотику.

Рекомбінантні плазміди, pDrrAB25, pDrrC25 і pDrrABC25 були побудовані надекспресією drrAB, drrC і drrAB в S. peucetius АТСС 27952 відповідно.

Олігонуклеотиди були використані для ампліфікації нуклеотидних послідовностей drrA і drrB одночасно з геномної ДНК S. peucetius, і продукт ПЛР клонували в pIBR25 на сайтах XbaI і EcoRI, щоб отримати рекомбінантну експресійну плазміду pDrrAB25. Аналогічно була побудована плазмида pDrrC25 на сайтах EcoRI і Hin DIII [27].

Рекомбінантними штамами продукувалося більше доксорубіцину, ніж батьківський штамом: 2,2-кратне збільшення з pDrrAB25 (2,6 мг/л), 5,1-кратним збільшенням pDrrC25 (6,5 мг/л) і 2,4-кратним збільшенням з pDrrABC25 (3 мг/л).

Також доксорубіцин продукується штамом Streptomyces coeruleorubidus, але його здатність продукувати доксорубіцин нижча , ніж у S. рeucetius. Тому . coeruleorubidus використовують для отримання іншого антибіотику - даунорубіцину.

Отже, наведені дані свідчать про можливість використання мутантів, стійких до даунорубіцину i доксорубіцину, у селекції S. peucetius var. сaesius. та здатність мутантів до перетворення екзогенного даунорубіцину у доксорубіцин. Для культивування обрано рекомбінантний штам S. peucetius pDrrC25, який синтезує 6,5 мг/л доксорубіцину [27].

.2 Наведення складу поживного середовища

Виробничий штам Streptomyces peucetius ATCC 27952 пропонується вирощувати на середовищі, складу, г/л:

.3 Морфолого-культуральні та фізіолого-біохімічні ознаки біологічного агента

Морфолого-культуральні ознаки. peucetius - типовий представник стрептоміцетів, які являють собою тонкі (0,3-1,5 мкм) нитки - міцелій, що проявляється у них в оптимальних для існування умовах.

Склад оболонок близький до бактеріального. Клітинна стінка 1-го типу, містять L-діамінопімелінову кислоту, гліцин і невеликі кількості арабінози. Характеризуються високим вмістом ГЦ пар у ДНК [3]. Грам-позитивна культура.

Рід Streptomyces є найбільшим родом, що синтезує антибіотики і використовується з 1940-1950 р. в їх промисловому виробництві [3].

Стрептоміцети ростуть в рідкому середовищі у вигляді плівки на поверхні, іноді утворюють пухнастий осад, залишаючи середовище абсолютно прозорим, на відміну від типових бактерій. При рості на твердому середовищі утворюють добре розвинений повітряний міцелій, що не розпадається в процесі розвитку на окремі клітини [3].

Спори, що проростають на твердому середовищі або фрагменти міцелію дають гіфи, проникаючі в агар (субстратний міцелій), а також гіфи, які багаторазово гілкуються і щільно переплітаються на поверхні агару, утворюючи щільні колонії діаметром 1 - 10 мм. [3]. Ступінь щільності колоній залежать від складу середовища. Ріст колоній S. peucetius зображено на рис. 2.1.

Рис. 2.1. Ріст колоній S. peucetius на поверхні агару

У деяких штамів роду Streptomyces колонії покриває повітряний міцелій - вільні гіфи, які мають гідрофобну оболонку і зростають вертикально вгору від поверхні колонії. На стадії утворення спор колонії стрептоміцетів стають порошкоподібними чи бархатистими, їх легко відрізнити від типових бактеріальних колоній.

Фізіолого-біохімічні ознакиpeucetius - хемоорганогетеротроф, облігатний аероб. Оптимальна температура для біосинтезу та розвитку S. peucetius 30°С [14]. Оптимальне значення рН 6,5-8 [14].

Вважається що актиноміцети більш стійкі до висушування ніж неміцеліальні бактерії, завдяки чому вони домінують в пустельних грунтах. Актиноміцети ростуть при більш низькій вологості, ніж більшість грамнегативних бактерій [14].

Незважаючи на те, що штами S. peucetius АТСС 29050 та S. peucetius АТСС 27952 є продуцентами DNR та DXR, їх стійкість до власних антибіотиків значно нижча, ніж до актиноміцину D (Act D). Якщо Act D повністю пригнічує ріст цих штамів (на МС) лише у концентрації 200 мкг/мл то DNR та DXR - у концентрації 30 та 50 мкг/мл [5].

.4 Таксономічний статус

Таксономічне положення S. peucetius згідно ІХ видання Керівництва Бергі з систематики бактерій