Дипломная (вкр): Біосинтез антибіотика доксорубіцину

Таксономічне положення S. peucetius згідно філогенетичної класифікації

Таксономічне положення S. peucetius згідно Х видання Керівництва Бергі з систематики бактерій

РОЗДІЛ 3. ТЕХНІКО-ЕКОНОМІЧНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ

3.1 Потреба у цільовому продукті

У 1974 році доксорубіцин був удосконалений для застосування в США. Всі дослідження в той час були спрямовані на розробку такого похідного доксорубіцину, яке виявляло б такий або більший протипухлинний ефект, але при цьому мало б менш виражену кардіотоксичність.

Нові винайдені препарати мають ту ж загальну структуру антрациклінового кільця, але вони були дещо модифіковані. За останні 30 років досліджувалася протипухлинна дія більше ніж 2000 препаратів. Клінічні випробування деяких з них проводяться і зараз , але доксорубіцин залишається найбільш широко застосовуваним препаратом з усіх антрациклінів.

Антрацикліни - клас протипухлинних препаратів, що володіють широким спектром активності на злоякісні пухлини в організмі людини, за винятком раку товстої кишки [38].

На сьогодні в світі на препарати від ракових захворювань витрачається 895.2 млрд. доларів , а серцеві - 753 млрд., і все інше - набагато менше: 298.2 млрд. - такі витратина лікування від судинних захворювань, 204.4 млрд. - від ДТП , 193.3 - від СНІДу , 125.8 млрд. - від респіраторних захворювань (включаючи пневмонію).

За даними IMS, обсяг продажів в 2016 доксорубіцину гідрохлорид для ін'єкцій в США перевищив $ 30 мільйонів. Станом на 2016 рік в Україні на обліку в онкологічних установах знаходиться 960 тис. людей, смертність склала - 77417.

Рак є однією з основних причин смерті у світі - в 2014 році зафіксовано 7,6 млн випадків смерті від раку. Основними типами раку є:

рак легенів - 1,37 мільйона випадків смерті;

рак шлунка - 736000 випадків смерті;

рак печінки - 695 000 випадків смерті;

рак товстого кишечника - 608 000 випадків смерті;

рак молочної залози - 458 000 випадків смерті;

рак шийки матки - 275 000 випадків смерті.

Україна на другому місці в Європі за темпами поширення раку. Ризик розвитку онкологічних захворювань становить 27,7% для чоловіків і 18,5% для жінок. Злоякісні новоутворення вражають в Україні кожного четвертого чоловіка і кожну шосту жінку.

Щорічно в Україні більше 160 тис. чоловік дізнаються, що вони онкохворі. Щороку від раку помирають близько 90 тис. осіб, з них 35% люди працездатного віку.

За розрахунками фахівців, до 2020 року кількість вперше захворілих на рак в Україні перевищить 200 тис.

За останні десять років кількість хворих зросла на 25%, загальна чисельність населення скоротилася на 4 млн. чоловік. Онкологічна захворюваність стабільно зростає на 2,6-3% на рік, і рак продовжує «молодіти». Здавалося б, за цими показниками ми не сильно відрізняємося від розвинених країн, проте слід враховувати, що середня тривалість життя українців на 10-20 років нижча, а захворюваність на рак істотно зростає після 50 років. І далеко не кожен українець доживає до «свого раку», вмираючи від інших причин.

Основними фірмами-виробниками доксорубіцину є:

«Фармстандарт-біолек» (Україна) - харківське підприємство з виробництва імунобіологічних та лікарських препаратів. Являється одним з найстаріших фармацевтичних підприємств на Україні. Було засновано в 1898 році і стало першим в Україні підприємством з виробництва імунобіологічних препаратів, вакцин і сироваток. Пріоритетним напрямком є ​​випуск цитотоксичних антибіотиків для лікування онкологічних захворювань, також засобів для наркозу, гормональних і ферментних препаратів та інше.

ТОВ «Сінбіас Фарма» (Україна) - донецька компанія, яка займається виробництвом протипухлинних субстанцій. На підприємстві створено повний цикл виробництва антрациклінових антибіотиків. В даний час протиракові препарати поставляються в багато країн світу. У 2005 р. отримані Європейські Сертифікати Відповідності, а також Сертифікат Належної Виробничої Практики (GMP ) від уповноваженого відомства Німеччини, що дозволяє підприємству авторизувати свою продукцію для використання в ЄС.

ЗАТ «Бринцалов-А» - «Ферейн» (Росія) є одним з найстаріших і великих фармацевтичних підприємств країни діє з 1912 року. Сьогодні ЗАТ "Бринцалов-А" виробляє високоефективні медичні препарати: антибіотики, серцево-судинні препарати, антидепресанти, онкологічні препарати та ін.

«Ленс-Фарм» (Росія) - компанія, яка працює на фармацевтичному ринку з 1991 року. У 1999 році фірма «Ленс-Фарм» розпочала реалізацію програми виробництва онкологічних препаратів, яка вважається одним з головних напрямків у роботі фірми в даний час.

«Teva Pharmaceutical Industries» - міжнародна фармацевтична компанія зі штаб-квартирою в Ізраїлі. Компанія являється значним світовим виробником препаратів-генериків, що входять до топ-10 фармацевтичних компаній. Історія Teva в Україні почалася в 1997 році з відкриття представництва та виведення на фармацевтичний ринок доступних генеричних онкологічних препаратів.

«EBEWE Pharma» (Австрія) - 1934 року займає провідне місце в австрійській фармацевтичної промисловості. Фірма має один із найсучасніших у Європі високоякісної технологією виробництва, яка відповідає вимогам GMP, що висуваються до виготовлення фармацевтичних препаратів. Лікарські препарати фірми EBEWE застосовуються в різних областях медицини, таких як: неврологія, кардіологія, гастроентерологія, онкологія і т.д.

«Schering Plough» (Німеччина) - корпорація, яка була заснована в 1851 році Ернстом Християном Фрідріх Шерінгом як «Schering AG». «Schering Plough» випускає фармацевтичні препарати, найбільш відомими з яких є протиалергенні «Кларитин» і «Clarinex» та протипухлинний препарат «Temodar» (для лікування пухлини головного мозку). Доксорубіцин випускається під торговою назвою «Келикс».

.2 Розрахунок потужності виробництва

Доксорубіцин застосовується в хіміотерапії майже всіх видів пухлин: гострий лімфобластний і мієлобластний лейкоз; злоякісна лімфома ходжкинського і неходжкинського типу; рак шлунка, рак підшлункової залози; рак сечового міхура; раку молочної залози, легень, сечового міхура, щитовидної залози, яєчників; рак ендометрія, рак шийки матки, рак передміхурової залози, гострий лімфобластний лейкоз, гострий мієлобластний лейкоз, хронічний лімфолейкоз, мієломна хвороба; остеогенна саркома; саркома м'яких тканин; саркоми Юінга; нейробластома [35].

Згідно даних Інституту раку за 2014 рік в Україні 960 тис. осіб перебувають на обліку в онкологічних установах. І приріст щорічно складає в середньому 0,6%. Отже станом на 2015 рік кількість хворих складає 960000×1,006 = 971555 осіб.

За тими ж даними склад хворих такий: 1/3 - чоловіки, 2/3 - жінки.

Схема курсу лікування: препарат вводиться пацієнту протягом 4 тижнів по 3 дні в кількості 20-30 мг/м2 . За курс необхідно 4×3 = 12 введень. Дозу беремо в середньому 25 мг/м2. Підрахувавши 25×12 отримаємо 300 мг/м2, тобто за 1 курс хворому необхідно ввести 300 мг/м2 препарату.

Згідно даних Держкомстату МОЗ України при лікуванні раку 33,92 % обирають хірургічний спосіб, 24 % - гормонотерапію, 18 % - променеву терапію, 23,28 % - хіміотерапію і 0,8 відмовляються від лікування. Провівши підрахунки робимо висновок, що лікують пухлини за допомогою хіміотерапії 971555×0,2328 = 226178 осіб.

Як протипухлинні, на сьогодні, застосовують понад 50 препаратів, а потенціальних засобів вивчено понад 500000. Головним недоліком більшості протипухлинних препаратів є мала вибірковість дії стосовно пухлинних клітин. Крім того, швидко виникає звикання клітин до препаратів.

Процес звикання можна уповільнити шляхом комбінованого застосування препаратів з різною структурою і неоднаковим механізмом дії. Протибластомним засобам властиві тяжкі побічні і токсичні ефекти. При цьому уражаються кістковий мозок, слизові оболонки кишечнику, виявлено негативний вплив на статеві залози (застосування протибластомних препаратів може зумовити стерильність). Ці засоби також виявляють імунодепресивну, мутагенну і тератогенну дії. В деяких випадках для зменшення токсичної дії і підвищення ефективності препаратів їх вводять внутрішньоартеріально безпосередньо до пухлини. Останнім часом як один з компонентів комбінованої терапії при пухлинних захворюваннях використовують імуностимулювальні засоби. В основі комбінованої терапії пухлин лежить принцип використання препаратів з різною хімічною будовою і механізмом дії.

Класифікація протипухлинних засобів

Алкілювальні засоби (циклофосфан, тіофосфамід, мієлосан)

Антиметаболіти (меркаптопурин, метотрексат, фторурацил)

Алкалоїди (колхамін, вінбластин, вінкристин)

Антибіотики (брунеоміцин, блеоміцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дактиноміцин, ідарубіцин, іксабепілон, мітоміин, епірубіцин)

Гормональні та антигормональні засоби (фосфестрол, флутамід)

Ферментні засоби (L-аспарагіназа).

Кожен з наведених препаратів має сильно виражену побічну дію: нудота, блювання, алопеція, лейкопенія, геморагічний цистит, агранулоцитоз з явищами геморагічного діатезу, анемія, анорексія, аменорея, тромбоцитопенія, гіпоплазія або аплазія кровоносної системи тощо.

Серед антибіотичних препаратів велика кількість належить до напівсинтетичних, тобто молекула була штучно покращена. Антибіотичні препарати також мають достатньо високу вартість, що також слід враховувати при виборі хіміотерапевтичних препаратів.

При розробленні проекту ми обираємо як препарат лікування саме доксорубіцин. Даний препарат характеризується порівняно незначними побічними реакціями та невисокою вартістю (100 грн за 10 мг) порівняно з іншими.

Для проходження курсу лікування одним хворим треба 300 мг/м2 доксорубіцину, а для лікування всіх хворих - 300×226178 = 67853400 мг/м2 =67853,4 г/м2 тіла препарату.

Враховуючи, що в середньому поверхня тіла чоловіків складає 1,9 м2 , а жінок - 1,6 м2 , а співвідношення кількості хворих чоловіків до жінок 1:2 отримаємо, що середня площа поверхні тіла пацієнта (1,9+1,6+1,6)/3 = 1,7 м2.

Якщо середня поверхня тіла хворого 1,7 м2, а пацієнтів всього 226178 і на лікування одного за курс витрачається 300 мг/м2 препарату, то для проходження повних курсів лікування всіх осіб необхідно 1,7×226178×300 = 115350780 мг = 115,5 кг доксорубіцину.

В Україні Доксорубіцин у вигляді лікарського препарату випускається лише двома фірмами (ПАО «Фармстандарт-Биолек» та Корпорація «Артеріум»), а решта постачається в нашу країну закордонними імпортерами. Проект виробництва спрямований на ліквідацію іноземної продукції з українського ринку. Враховуючи кількість продукції, випускаємої вітчизняними виробниками, дане виробництво забезпечить 70% потреби в антибіотику.

Отже, потужність виробництва складає 82 кг доксорубіцину за рік.

Зважаючи на те, що не всі хворі будуть використовувати доксорубіцин при лікуванні приймемо, що 30 % виробленої продукції буде експортовано.

Оскільки вихід доксорубіцину (концентрація у культуральній рідині) становить 0,85 г/л = 0,85 кг/м3, а потреба в Україні 82 кг/рік, то розрахуємо об’єм культуральної рідини за рік:

VКРріч= 82/0,85 = 92,59 м3

Окрім цього, нам необхідно врахувати втрати, які можуть виникнути в процесі виробництва, вони становлять 10%, отже, з урахуванням втрат річний об’єм культуральної рідини становитиме:

КРріч =92,59+92,59 × 0,1=111 м3

.3 Розрахунок кількості виробничих циклів

для отримання річної потреби цільового продукту і геометричного об’єму ферментера

. Приймаємо кількість робочих днів на рік - 300.

Ефективний фонд робочого часу Nеф. = 300×24 = 7200 год.

Розрахуємо цикл роботи ферментера:

Tцф = Tф+Tдр = 148+14 = 162 (год), де

Tф - тривалість виробничої ферментації (біосинтезу);др - тривалість допоміжних робіт (допоміжні роботи включають: миття та огляд (4 год), перевірка на герметичність (2 год), стерилізація (2 год), охолодження (1 год), завантаження середовища (2 год), засів (1 год), вивантаження культуральної рідини (1 год).

. Кількість циклів за рік становитиме:

nц==44,4, округлюємо до 44 циклів.

Об’єм культуральної рідини, який треба одержати за цикл:

VКРц= VКРріч/ nц=111/44=2,5 м3

Обираємо ферментер об'ємом 5 м3 з коефіцієнтом заповнення Кз = 0,5. Об'єм культуральної рідини становить Vк.р = 2,5 м3, що більше за розрахований.

.4 Розрахунок кількості стадій підготовки посівного матеріалу

Виробничий біосинтез здійснюють у ферментері об’ємом 5 м3 з коефіцієнтом заповнення, 0,5.

Робочий об’єм ферментера (Vроб) визначають за формулою:

Vроб.=Vг.ф.×Кзап., (2.1)

де: Vг.ф. - геометричний об’єм ферментера;

Кзап- коефіцієнт заповнення, 0,5.

Vроб.=5×0,5 =2,5 м3

Кількість посівного матеріалу (доза) становить 10 % від об’єму поживного середовища. Отже, для одержання 2,5 м3 культуральної рідини потрібно:роб.1=2,5×0,1=0,25 м3 посівного матеріалу.

Для одержання 0,25 культуральної рідини треба мати:роб.2=0,25×0,1=0,025 м3 посівного матеріалу.

л культуральної рідини можна одержати з використаннямроб.3=25×0,1=2,5 л посівного матеріалу.

Приготування такої кількості інокуляту здійснюють в качалочних колбах об‘ємом 0,75 дм3. Кількість колб - 17 шт..

Для одержання 2,5 л культуральної рідини потрібно мати:роб.4=2,5×0,1=0,25 л посівного матеріалу.

Таку кількість посівного матеріалу одержують культивуванням культури штаму Streptomyces peucetius ATCC 27952 в качалочних колбах об‘ємом 0,75 дм3. Кількість колб - 2 шт.

Отже, процес одержання посівного матеріалу для забезпечення виробничого біосинтезу доксорубіцину у ферментері об’ємом 5 м3 з коефіцієнтом заповнення 0,5 буде проходити у 4 етапи [10].

РОЗДІЛ 4. БІОСИНТЕЗ ЦІЛЬОВОГО ПРОДУКТУ

4.1 Шляхи катаболізму ростового субстрату у біологічного агента

Основним вуглецевим субстратом для вирощування Streptomyces peucetius є декстран, з якого потім утворюється глюкоза. Катаболізм глюкози здійснюється за гліколізом (шлях Ембдена-Мейєргофа-Парнаса, фруктозо-1,6-дифосфатний шлях). Процеси перетворення глюкози на гліцеральдегід-3-фосфат пов’язані з витратами енергії. Під час подальшого окиснення гліцеральдегід-3-фосфату до пірувату енергія вивільнюється. Перетворення 1,3-дифосфогліцерату на 3-фосфогліцерат спряжено з фосфорилюванням АДФ і утворенням АТФ (фермент фосфогліцераткіназа). Ця реакція є одним з пунктів гліколізу, в яких АТФ утворюється в результаті фосфорилювання на рівні субстрату. Фосфоенолпіруват (ФЕП) - це друга сполука, яка містить фосфорильний зв’язок з високою енергією гідролізу: при утворенні пірувату з ФЕП фосфат переноситься на АДФ з утворенням АТФ (фермент піруваткіназа). Ця реакція є другим пунктом утворення АТФ на рівні субстрату у шляху Ембдена - Мейєргофа - Парнаса. Обидві реакції, які проходять з виділенням енергії (утворенням АТФ) у процесі перетворення гліцеральдегід-3-фосфату на піруват є для анаеробних мікроорганізмів основними етапами, які постачають енергію. Усі реакції за винятком трьох (гексокіназної, фосфофруктокіназної та піруваткіназної), є повністю оборотними [25].