Дипломная (вкр): Біосинтез антибіотика доксорубіцину

.2 Біотрансформація ростового субстрату у цільовий продукт

Основними сполуками синтезу доксорубіцину культурою S. peucetius є 7,9,12-декакетиди, що утворюються в результаті конденсації Малон-КоА, метилмалон-КоА і бутаніл-КоА. В утворенні 12-дизоксиакланонової кислоти беруть участь 4 ферменти, 2 з яких належать до кетоацилсинтаз. Під дією

оксидоредуктази утворюється акланонова кислота, яка через метиловий ефір, аклавікетон, родоміцин і похідні карміноміцину перетворюється на доксорубицин [19].

Схему біотрансфомації від мальтози до антибіотика Доксорубіцину у S. peucetius зображено на рис 4.1.

Рис 4.1. Схема біосинтезу доксорубіцину

Ферменти які беруть участь у біосинтезі доксорубіцину

- декстраназа; 2 - гексокіназа; 3 - глюкозофосфатізомераза; 4 - фосфофруктокіназа; 5 - фруктозодифосфатальдолаза; 6 - триозофосфатізомераза; 7 - гліцеральдегідфосфатдегідрогеназа; 8 - фосфогліцераткіназа; 9 - гліцератфосфомутаза; 10 - енолаза; 11 - піруваткіназа; 12 - ізоцитратліаза; 13 - глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа; 14 - глюконат-6-фосфатдегідрогеназа; 15 - трансельдолаза і транскетолаза; 16 - глюкозофосфатізомераза.

5.1 Обґрунтування способу культивування і типу ферментера

Вибір способу проведення біосинтезу відіграє важливу роль в процесі росту мікроорганізмів. Існують різні види культивування: глибинне, поверхневе, періодичне, безперервне [14].

Найбільш поширений спосіб культивування - періодичний. При даному способі культивування інокулят вносять у поживне середовище, яке містить задану кількість всіх необхідних поживних речовин. При цьому ні один із компонентів поживного середовища не надходить у систему у процесі культивування, тобто це закрита система [14].

Періодичне культивування застосовується як для поверхневих культур (на поверхні твердого поживного середовища), так і глибинних культур (в рідкому поживному середовищі). Ріст мікроорганізмів у поживному середовищі припиняється тоді, коли вміст якого-небудь з необхідних компонентів середовища досягає мінімуму або у середовищі накопичуються продукти метаболізму, що інгібують ріст мікроорганізмів.

Глибинне культивування мікроорганізмів має ряд очевидних переваг перед поверхневим, оскільки дозволяє значно скоротити виробничі площі, виключити важку непродуктивну ручну працю, покращити гігієну праці, спрощує механізацію та автоматизацію виробництва, робить можливим перехід на безперервний спосіб культивування. При глибинному способі культивування раціональніше використовуються поживні речовини середовищ, що дають можливість значно скоротити відходи виробництва у вигляді нерозчинних осадів твердого поживного середовища, отримувати препарати з меншим вмістом домішок і більшою питомою активністю. Глибинне культивування проводять у вертикальних герметичних ємностях різного розміру, що називаються ферментерами [14].

При поверхневому культивуванні механізація процесу вирощування можлива шляхом створення безперервно діючих установок. В цьому випадку мікроорганізми вирощують на поверхні щільного середовища або в тонкому шарі рідкого середовища, і кисень надходить до них безпосередньо з повітря.

Оскільки S. peucetius накопичує лише 6,5 мкг/мл доксорубіцину, то для забезпечення необхідної потужності виробництва необхідні великі об’єми поживного середовища. Отже застосування поверхневого способу є недоцільним. Також у ході культивування середовище слід підживлювати, що при поверхневому способі культивування є трудомістким.

Тому, враховуючи дані, наведені вище, для культивування S. peucetius обираємо глибинний метод, бо цей мікрорганізм росте у рідкому поживному середовищі, потребує постійної аерації, частого технологічного контролю, також за глибинного методу культивування економляться виробничі площі.

Біореактори (ферментери) складають основу біотехнологічних виробництв. Розрізняють такі типи ферментерів: лабораторні місткістю 0,5-100 л, промислові ємністю 1-100 м3 і більше. Обладнання, що застосовується в біотехнології у ході його експлуатації і поза її повинно бути легко доступним, функціонувати в певних рамках вимог гігієни і санітарії. У разі заміни будь-яких частин або деталей в апараті, чищення вузлів при поточному ремонті, і т. д., забруднення не повинні потрапляти всередину біореакторів, в матеріальні потокові комунікаційні лінії, в кінцеві продукти [14].

Проведення культивування S. peucetius передбачає забезпечення інтенсивного перемішування та аерації середовища. В обраному ферментері повинен бути достатній рівень масообміну, що досягається встановленням мішалки та повітря, яке подається через барботер. Застосування турбінної мішалки розташованої над барботером забезпечить високий рівень диспергування повітря, сприяючи збільшенню поверхні контакту фаз та коефіцієнту масопередачі. Оскільки турбінні мішалки забезпечують інтенсивне перемішування по всьому об’єму апарата [14]. Основною перевагою механічного перемішування є те, що можна легко змінювати технологічні умови та ефективно доставляти до зростаючих клітин повітря, що визначає характер розвитку мікроорганізмів і їх біосинтетичну активність. Для подачі гарячої/холодної води ферментер має бути оснащений рубашкою, щоб підтримувати необхідну температуру (30 °С) культивування.

Отже, для культивування S. peucetius найефективнішим являється ферментер з механічним перемішуванням барботажного типу, оснащений рубашкою, оскільки в ньому легко можна варіювати режими перемішування та масообміну, забезпечується рівномірний розподіл мікроорганізмів та компонентів поживного середовища.

.2 Обґрунтування вибору стадії підготовки повітря

При вирощуванні мікроорганізмів в глибинних умовах потрібна безперервна подача стерильного повітря в ферментер, посівний апарат та інокулятори, на аерацію культуральної рідини. Повітря, що подається в ферментер, не тільки забезпечує культуру киснем, а і відводить газоподібні продукти обміну і фізіологічне тепло, яке виділяється мікроорганізмами в процесі розвитку, дозволяє досягти однорідності мікробної суспензії, збільшує швидкість масопередачі і перемішування рідкого поживного середовища.

Очистка і стерилізація повітря досягаються різними способами, які передбачають перш за все знищення мікроорганізмів або їх відділення. Використовуються методи газової очистки або застосування антисептиків, підвищення або пониження температури, ультрафіолетове випромінення, іонізуюче випромінення. Ці складні прийоми мало економічні через високу стійкість спор і конідій до високих температур і іонізуючого випромінювання. В процесах мікробіологічного синтезу повітря, що подається на аерацію повинно бути очищене на 99,9999 % від домішок і мікроорганізмів розміром до 1 мкм. Ця вимога примушує відмовитись від багатьох методів газової очистки як неефективних, що забезпечують виділення лише великих часток.

Найбільше розповсюдження отримав метод фільтрації повітря через волокнисті, пористі або зернисті матеріали. Такі матеріали недорогі і мають високу ефективність стерилізації.

Для попередньої очистки в даній роботі використовується фільтр ячейковий з пінополіуретаном, який є відносно стійким. Фільтри працездатні і зберігають свої технічні характеристики при температурі повітря, що очищається, від -40 °С до +70 °С. Навколишнє середовище і фільтроване повітря не повинне містити агресивних газів і пари.

Фільтри грубої очистки призначені для уловлювання основної маси забруднень, які потрапили в систему після проходження фільтрів попередньої очистки і компресора. Як правило це фільтри великої ємкості і є головними. Головний фільтр дублює роботу індивідуальних фільтрів і підвищує степінь очистки та стерилізації повітря. У даній технології для грубої очистки використовується рулонний фільтр з волокнами полімеру.

Фільтри тонкої очистки і стерилізації необхідні для уловлювання забруднень пропущених іншими фільтрами, а також всіх інших можливих забруднень, що потрапили в систему випадково. Конструктивно фільтри тонкої очистки дуже схожі на фільтри грубої очистки, тільки вони значно менші за розмірами і в них використовуються більш ефективні фільтруючі матеріали. В даній роботі використовується бактеріальний фільтр з фторопластовою мембраною або тканиною Петрянова, встановлюється звичайно біля кожного ферментатора чи реактора окремо.

Для стерилізації фільтрів та повітряних ліній застосовують найчастіше гостру пару. Цей метод створює дуже жорсткі умови для вибору фільтруючих матеріалів, так як через фільтр під тиском пропускається велика кількість гострої пари, часто забрудненої і з великим вмістом конденсату. Тому більш раціональна двостороння стерилізація фільтрів парою. Пара повинна поступати чиста і суха температурою 120 °С при стабілізованому тиску. Час стерилізації коливається від 30 до 60 хв в залежності від типу фільтруючого матеріалу.

.3 Вибір мийних та дезінфікуючих засобів

Методи дезінфекції поділяються на фізичні і хімічні. До фізичних методів дезінфекції відноситься термічна дія у різних проявах, ультразвук, ультрафіолетові промені, рентгенівські промені, радіоактивні випромінювання та ін. В процесі виробництва доксорубіцину пропонується використовувати відносно безпечні та зручні методи, такі як оброблення парою (лабораторний посуд) та ультрафіолетовими променями (дезінфекція лабораторного боксу).

До засобів хімічних методів дезінфекції відносяться хімічні речовини, що мають бактерицидні властивості й відповідають таким вимогам: добра розчинність у воді, швидкість дії, нетоксичність, нешкідливість для обеззаражуваних предметів, забезпечувати нейтралізацію кислих забруднень та омилення жирів (для лужних мийних засобів); забезпечувати повне змочування поверхонь із різних конструкційних матеріалів, видалення механічного, білкового та жирового забруднень шляхом їх диспергування та емульгування; вони не повинні втрачати бактерицидних властивостей при контакті з оброблювальним матеріалами та при зберіганні, бути дешевими та легко транспортуватися.

Протимікробну дію проявляють лише ті препарати, які містять вільний елемент, зокрема хлор, що вивільняється з хлорного вапна, хлораміну Б чи хлоргекседину. Сполуки, до складу яких входять галогени у зв'язаному стані, але вони не вивільняються, наприклад, калію йодид, натрію хлорид тощо, протимікробних властивостей не мають.

Механізм протимікробної дії галогенів полягає в денатурації білків протоплазми мікробних клітин шляхом взаємодії з аміногрупами цих білків. Атоми хлору витісняють із цих груп водень. Денатурований таким чином білок втрачає свої властивості. В присутності органічних речовин їх протимікробний ефект значно зменшується.

Хлор - дуже активний бактерицидний елемент. Він проявляє протимікробну дію у формі недисоційованої хлорної кислоти (HOCl), яка утворюється при розчиненні хлора у воді при нейтральному чи кислому значеннях рН. На підприємствах використовуються хлорвмісні препарати - хлорне вапно, хлорамін Б і хлоргексидин.

Хлорамін Б - препарат, що містить 25-29 % активного хлору. З нього цей елемент відщеплюється повільніше, тому засіб діє триваліше. Розчини хлораміну застосовують для дезинфекції приміщень та поверхні обладнання тощо. Хлорамін широко використовується для стерилізації води. 4-8 мг його в змозі простерілізувати 1 л води протягом 15-60 хв, якщо вона не містить значної кількості органічних речовин. Хлорамін Б має здатність знищувати неприємні запахи (дезодоруючі властивості).

Хлоргексидину біглюконат - бісдигуанідиновий дезинфікуючий і антисептичний засіб. Він здатний пошкоджувати плазматичну мембрану мікроорганізмів, особливо грамнегативних. Має бактерицидні властивості відносно грампозитивних і грамнегативних штамів патогенних мікроорганізмів, найпростіших, грибів. Не впливає на мікобактерії і спори.

Очищає і обезмікроблює шкіру, не пошкоджуючи її. Застосовується для обробки рук персоналу, робочих поверхонь в лабораторіях, 0,1 % водним розчином цього антисептика користуються для загальної дезинфекції приміщень, санітарного транспорту й обладнання. Може входити до складу комбінованих препаратів

Фенол, або кислота карболова. Як протимікробний засіб в 3-5 % розчинах застосовується для дезинфекції приміщень та поверхні обладнання.

Спирт етиловий - це засіб, протимікробна дія якого полягає в здатності забирати воду і викликати денатурацію білків протоплазми мікроорганізмів. На спорові форми не впливає. Бактерицидна дія починає проявлятися вже в розчині з концентрацією 20 %. Із її збільшенням цей ефект зростає. Але в білковому середовищі високі концентрації спирту утворюють щільні білкові конгломерати, в середині яких можуть знаходитись живі мікроорганізми. Тому на практиці, наприклад, для знезаражування шкіри, доцільніше використовувати 70 % спирт, тому що в такій концентрації він добре проникає в глибину шкіри, в протоки сальних і потових залоз, забезпечує високий антисептичний ефект в найближчі хвилини. За силою протимікробної дії 70 % спирт етиловий прирівнюється до 3 % розчину фенолу або 0,1 % розчину ртуті дихлориду.

Як протимікробний засіб спирт етиловий застосовується для обробки рук персоналу і робочої зони в лабораторії (70 %), стерилізації інструментів (90-95 %) тощо. Нерідко він використовується в поєднанні з іншими протимікробними засобами у вигляді розчинів.

Розчин перекису водню - прозора безбарвна рідина. Швидко розкладається на світлі, при нагріванні, під впливом різних сполук. Отримують його шляхом розбавлення водою концентрованого розчину перекису водню (пергідролю). Для дезінфекції використовуються 3 % та 6 % розчини перекису водню.

Приготування дезінфікуючих розчинів забезпечує відповідну якість дезінфікуючих розчинів для дотримання потрібного рівня асептики. Дана операція являється підготовчою для наступних операцій санітарної підготовки, які, в свою чергу, включені в технологічну схему для попередження контамінації. Допускається використовувати мийні, дезінфекційні, мийно-дезінфекційні засоби та антисептики, які в установленому порядку зареєстровані в Україні і дозволені до використання на підприємствах хіміко-фармацевтичної та біотехнологічної промисловості.

При використанні мийно-дезінфекційних засобів поєднують стадії миття та дезінфекції об'єктів в одній операції (виключають використання розчинів мийних засобів). Рекомендується чергувати дезінфекційні та антисептичні засоби кожні 1-3 місяці з метою запобігання розвитку та розповсюдженню стійких варіантів мікроорганізмів.

Готують дезрозчини в спеціальному посуді, зберігають обмежений час щоб уникнути зростання мікроорганізмів. Розчини використовують тільки свіжоприготованими. Розчини мийних, дезінфекційних, мийно-дезінфекційних засобів використовують одноразово (вони не підлягають повторному використанню).

В залежності від концентрації перекис водню проявляє бактерицидну, спороцидну дію, в більшій концентрації (6 %) застосовують для позбавлення від цвілі, тобто є універсальним. На відміну від альдегідів не проявляє подразнюючої дії , не накопичується в організмі людини, як сполуки металів, малотоксичний. Саме тому перекис водню доцільно використовувати в технології такого типу.

Таким чином, із запропонованих засобів вибираємо розчини перекіс водню різної концентрації, спирт етиловий та Хлорамін Б.

.4 Особливості підготовки та стерилізації поживного середовища

В залежності від фізико-хімічних властивостей компонентів поживного середовища та їх об’єму, обирають обладнання для стерилізації [14].

Виходячи з наведених вище розрахунків, проаналізуємо можливі способи стерилізації поживного середовища для різних етапів підготовки інокуляту та для самого процесу біосинтезу.

На першому етапі для приготування посівного матеріалу в колбах потрібно 250 мл поживного середовища, а для першого інокулятора - 2,5 л. Для стерилізації компонентів обираємо автоклав. Поживне середовище для колб стерилізуємо в колбах місткістю 1 л, а середовище для інокулятора стерилізуємо у колбах місткістю 2 л. Важливо відмітити, що окремо від солей стерилізуються карбонвмісні компоненти при t = 112 0C.