Феномен формирования диффузных зон при изучении липолитической активности можно объяснить замедленной диффузией фермента в агарозный гель с субстратом или частичной его деградацией в процессе электрофореза или во время блоттинга. При сравнении реплик, полученных после переноса с ПААГ, и исходного окрашенного геля, оказалось, что основной липолитической активностью обладают белки, молекулярная масса которых лежит в диапазоне от 31 до 100 кДа. Установлена значительная вариабельность липолитической активности в зависимости от используемого субстрата и токсигенности штаммов холерного вибриона. Более высокая способность препаратов МЭ, приготовленных из нетоксигенных штаммов вибриона Эль Тор O1 и из токсигенных штаммов холерного вибриона O139 серогруппы к гидролизу субстратов, содержащих короткоцепочечные жирные кислоты (Твин-20) может быть обусловлена преобладанием в препаратах указанных штаммов эстераз. Более высокая активность препаратов МЭ из токсигенных штаммов в отношении Тритона X-305, в состав которых входят длинноцепочечные жирные кислоты, можно связать с действием липаз. Обнаруженные различия в липолитической активности препаратов в отношении используемых субстратов отражают индивидуальные свойства взятых в исследование штаммов, и, по-видимому, связаны как с разным составом липолитических ферментов, удельной активностью полученных из них препаратов, так и чувствительностью к факторам внешней среды и в целом отражают интенсивность липидного обмена микробной клетки.
Обнаруженные закономерности в проявлении муциназной активности, заключающиеся в её определении преимущественно у токсигенных штаммов, могут свидетельствовать о существенном вкладе муколитических ферментов в патогенез холерной инфекции.
В целом обнаруженные в ходе проведённых экспериментов различия в степени гидролитической активности у препаратов, полученных из штаммов холерного вибриона разного происхождения, указывают на некоторые закономерности: в среднем гидролитическая активность нетоксигенных штаммов (хитозаназная) выше таковой токсигенных штаммов холерного вибриона, что говорит об их вкладе в адаптационно-приспособительный потенциал нетоксигенных изолятов, выделенных из ООС. Выявленная более высокая РНК-азная и липолитическая активность у препаратов из токсигенных штаммов может указывать на роль данных ферментов в вирулентности возбудителя. Отмеченная превосходящая суммарная гидролитическая активность препаратов СКЖ по сравнению с препаратами субклеточных фракций, говорит о повышенной активности секретируемых ферментов у взятых в исследование штаммов холерного вибриона.
Таким образом, в результате проведённого зимографического анализа с применением комплекса специфических субстратов, установлено наличие в полученных из штаммов V. cholerae O1 и O139 препаратов МЭ, НМ и СКЖ хитозаназной, липолитической, лецитиназной, муциназной, РНК-азной и протеолитической активности. В ходе экспериментов с помощью прямой зимографии в ПААГ удалось добиться стабильно воспроизводимых и сопоставимых результатов по детекции гидролаз, относящимся к разным классам и по их продукции в препаратах выявить межштаммовые отличия. Прослеживается также зависимость степени активности обнаруженных гидролаз в тестах радиальной энзимодиффузии от токсигенности исходных штаммов, что может быть использовано для дополнительной фенотипической характеристики штаммов в отношении их потенциальной эпидзначимости и персистентного потенциала. Штаммы-продуценты обнаруженных гидролаз в дальнейшем могут быть использованы для выделения и очистки этих ферментов в качестве протективных антигенов для конструирования субъединичной вакцины против холеры.
Список литературы
мембрана серогруппа супернатант штамм
1. Адамов А.К. Метаболический иммунитет к холере / А.К. Адамов - Саратов: Изд-во Саратовского университета., 1982. - 176 с.
2. Ашмарин И.П., Воробьёв А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьёв. - Л.: Медгиз., 1962. - 180 с.
3. Марков Е.Ю. Наружные мембраны холерного вибриона как потенциальный компонент химической вакцины / Е.Ю. Марков, Л.Я. Урбанович, Е.П. Голубинский [и др.] // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1995. - Вып 2. (Приложение). - С. 86-89.
4. Finkelstein R.A. Vibrio cholerae hemagglutinin/protease, colonial variation, virulence, and detachment / R.A. Finkelstein, M Boesman-Finkelstein, Y. Chang, [et al.] // Infect. Immun. - 1992. - Vol.60, N2. - P.472-478.
5. Galen J.E. Role of Vibrio cholerae neuraminidase in the function of cholera toxin / J.E. Galen, J.M. Ketley, A. Fasano [et al.] // Infect. Immun. - 1992. - Vol.60, N2. - P. 1358-1362.
6. Heussen C. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates / C. Heussen, E.B. Dowdle // Anal. Biochem. - 1980. - Vol.102, N1. - P. 196-202.
7. Lantz M.S. Zymographic techniques for detection and characterization of microbial proteases / M.S. Lantz, P. Ciborowski // Methods Enzymol. - 1994. - Vol.235. - P. 563-594.
8. Mondal M. The Vibrio cholerae extracellular chitinase ChiA2 is important for survival and pathogenesis in the host intestine / M. Mondal, D. Nag, H. Koley [et al.] // PLoS One. - 2014. - Vol. 9, N9. - P. e103119.
9. Seper A. Extracellular nucleases and extracellular DNA play important roles in Vibrio cholerae biofilm formation / A. Seper, V.H.I. Fengler, S. Roier [et al.] // Mol. Microbiol. - 2011. - Vol. 82, N4. - P. 1015-1037.
10. Shinoda S. Proteases produced by Vibrio cholerae and other pathogenic vibrios: pathogenic roles and expression / S. Shinoda - New York: Springer, 2011. - P. 245-258.
11. Zang P. Targeting druggable enzymome by exploiting natural medicines: An in silico-in vitro integrated approach to combating multidrug resistance in bacterial infection / P. Zang, A. Gong, P. Zhang [et al.] // Pharm. Biol. - 2016. - Vol.54, N4. - P. 604-618.