1ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
2ГБУЗ «Самарский областной клинический кардиологический диспансер»
Способы моделирования атеросклероза у кроликов
Чаулин А.М., Григорьева Ю.В., Суворова Г.Н., Дупляков Д.В.
Моделирование патологических состояний на лабораторных животных играет важную роль в изучении патофизиологии и патоморфологии различных заболеваний человека и последующей разработке и совершенствовании методов диагностики и лечения. Кролики были самыми первыми животными, использованными для моделирования атеросклероза более 100 лет назад отечественными учеными Аничковым и Игнатовским. К настоящему времени для изучения атеросклероза были разработаны несколько типов моделей атеросклероза с использованием кроликов: кролики, содержащиеся на холестериновой диете, наследственные гиперлипидемические кролики Ватанабэ, трансгенные кролики, «нокаутированные» кролики. Данные модели позволили сделать ряд важнейших открытий в области сердечно-сосудистых заболеваний и продолжают широко использоваться для изучения и уточнения патофизиологии и патоморфологии атеросклероза. Одним из главных факторов, ограничивающих использование животных для исследований в области трансляционной медицины, являются различия в метаболизме липидов. Кролики обладают практически сходными с людьми особенностями обмена липидов, что позволяет их использовать для трансляционных исследований сердечно-сосудистых заболеваний. В настоящем обзоре (1 часть статьи) описаны исторические аспекты использования способов моделирования атеросклероза у кроликов и отмечены важнейшие открытия, сделанные при помощи них. Также описываются особенности обмена липидов у кроликов и рассматриваются способы моделирования атеросклероза при помощи атерогенных (гиперхолестериновых) диет.
Ключевые слова: атеросклероз, холестерин, липопротеины низкой плотности, липопротеины высокой плотности, экспериментальные модели, кролики, метаболизм липидов, морфология, патофизиология, трансляционная медицина.
METHODS FOR MODELING ATHEROSCLEROSIS IN RABBITS
Chaulin A.M.1,2, Grigorieva Yu.V.1, Suvorova G.N.1, Duplyakov D.V.1,2
1FGBOU HE "Samara state medical University" of the Ministry of Health of the Russian Federation,
2GBUZ "Samara regional clinical cardiology dispensary"
Modeling of pathological conditions in laboratory animals plays an important role in the study of the pathophysiology and pathomorphology of various human diseases and the subsequent development and improvement of methods of diagnosis and treatment. Rabbits were the very first animals used to model atherosclerosis more than 100 years ago by Russian scientists Anichkov and Ignatovsky. To date, several types of models of atherosclerosis have been developed for the study of atherosclerosis using rabbits: rabbits contained on a cholesterol diet, hereditary hyperlipidemic Watanabe rabbits, transgenic rabbits, "knockout" rabbits. These models have made a number of important discoveries in the field of cardiovascular diseases and continue to be widely used to study and Refine the pathophysiology and pathomorphology of atherosclerosis. One of the main factors limiting the use of animals for research in translational medicine is differences in lipid metabolism. Rabbits have almost similar features of lipid metabolism to humans, which allows them to be used for translational research of cardiovascular diseases. This review (part 1 of the article) describes the historical aspects of the use of methods for modeling atherosclerosis in rabbits and highlights the most important discoveries made using them. It also describes the features of lipid metabolism in rabbits and considers ways to model atherosclerosis using atherogenic (hypercholesterol) diets.
Keywords: Atherosclerosis, cholesterol, low-density lipoproteins, high-density lipoproteins, experimental models, rabbits, lipid metabolism, morphology, pathophysiology, translational medicine.
Введение
Атеросклеротическое поражение сосудов является ведущей причиной сердечнососудистых заболеваний (ССЗ), в том числе инфаркта миокарда и инсульта, которые продолжают оставаться основными причинами смертности во всем мире. Данное обстоятельство создает необходимость непрерывных дальнейших исследований для улучшения лечебно-диагностических стратегий при ССЗ [1-4]. Атеросклероз медленно развивается на всех этапах жизни человека, и в его патогенезе участвует множество различных факторов и механизмов. Для изучения патофизиологии и патоморфологии атеросклероза, а также для разработки методов диагностики и лечения важное значение имеет использование соответствующих экспериментальных (доклинических) моделей. В целом идеальные модели атеросклероза у животных должны обладать несколькими важными характеристиками: легкое приобретение и обслуживание; небольшие затраты; надлежащий размер, которые позволит проводить необходимые манипуляции; идеальная модель должна иметь четко определенный генетический фон и обладать сходными с людьми особенностями обмена липидов и другими факторами, определяющими патофизиологию атеросклероза [5; 6]. Идеальной модели атеросклероза, соответствующей всем этим требованиям, не существует, поэтому для изучения различных аспектов атеросклероза было предложено немало различных экспериментальных моделей с использованием большого количества различных животных [7]. Кролики были самыми первыми животными, использованными для моделирования атеросклероза, и считаются одной из лучших моделей для изучения патофизиологии, патоморфологии атеросклероза и проведения трансляционных исследований.
1. Краткие исторические аспекты разработки моделей и исследования атеросклероза с использованием кроликов
История разработки экспериментальных моделей и исследований в области атеросклероза весьма насыщенна. Первый эксперимент по исследованию атеросклероза на кроликах был проведен более 100 лет назад. В 1908 году русский врач Игнатовский кормил кроликов пищей, обогащенной животными белками (молоком, мясом и яйцами), и наблюдал поражения интимы с большим скоплением крупных липидных клеток (теперь называемых пенистыми клетками) в аорте [8]. Несколькими годами позже российский экспериментальный патолог Аничков использовал холестерин, растворенный в растительном масле, чтобы вызвать атеросклероз аорты у кроликов и клинические проявления, подобные тем, которые наблюдались у людей; на основании полученных результатов предположил причинную роль холестерина в развитии атеросклероза [9; 10]. Однако поначалу данная липидная гипотеза не была принята другими исследователями, поскольку результаты исследования, полученные на кроликах, не были воспроизводимыми, т.е. у некоторых других животных холестериновая диета не вызвала атеросклероза [11]. В последующем благодаря открытиям в области физиологии и биохимии были обнаружены значительные межвидовые особенности обмена липидов. Так, например, объяснением повышенной устойчивости мышей к атеросклерозу служит необычайно высокая концентрация липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в плазме крови, и поэтому холестериновая диета Аничкова не вызывала у них атеросклеротических поражений, подобных тем, что наблюдались у кроликов и людей.
В настоящее время достигнут консенсус в отношении того, что как у людей, так и у экспериментальных животных избыточное поступление холестерина является одним из главных факторов, ведущих к развитию атеросклероза. Исследования на животных моделях предоставили первые экспериментальные доказательства и основу для установления «липидной гипотезы» атеросклероза [9]. Моделирование атеросклероза на кроликах широко использовалось для выяснения многих аспектов патоморфологии и патофизиологии атеросклероза человека наряду с разработкой терапевтических средств. В связи с этим следует особо отметить несколько важных вех в истории изучения атеросклероза, которые основаны на крупных новаторских достижениях и знаниях для понимания молекулярных и клеточных механизмов атеросклероза, представленных моделями атеросклероза с использованием кроликов. Экспериментальные (доклинические) модели животных являются крайне важными для трансляционной медицины; открытие новых регуляторных молекул, в частности PCSK-9, сортилина и др., изучение их роли в патофизиологии атеросклероза, а также разработка новых гиполипидемических препаратов преимущественно базируются на сведениях, полученных из экспериментальных исследований c использованием животных [912].
R. Mahley с соавт. одними из первых показали, что основные липопротеины, которые повышаются у кроликов в ответ на холестериновую диету, представляют собой ремнантные (остаточные) липопротеины печеночного происхождения, называемые бета- липопротеинами очень низкой плотности (Р-ЛПОНП), и именно эти липопротеины являются атерогенными, поскольку они богаты холестерином и могут индуцировать превращение макрофагов в пенистые клетки [13]. Watanabe et al. продемонстрировали, что на ранних стадиях атеросклеротического поражения аорты у кроликов, которым давали холестериновую диету, начальным клеточным событием является миграция моноцитов во внутреннюю оболочку сосудов (интиму), насыщение моноцитов липидами и превращение их в пенистые клетки [14]. Позднее G. Hansson и соавт. обнаружили, что, помимо моноцитов, в области атеросклеротического поражения у кроликов, получающих холестериновый рацион, также присутствуют Т-лимфоциты, что явилось первым доказательством участия иммунного ответа в патогенезе атеросклероза [15]. В последующем благодаря усилиям исследователей были обнаружены молекулы адгезии сосудистого эндотелия (VCAM-1) в эндотелиальных клетках аорты, экспрессия которых может усиливаться атерогенными липопротеинами (в-
ЛПОНП, ЛПНП) и усиливать адгезию (прикрепление) моноцитов к эндотелиальным клеткам. Таким образом, они предоставили первые доказательства того, что дисфункция эндотелиальных клеток, индуцированная атерогенными липопротеинами, играет важную роль в адгезии моноцитов к эндотелию сосудов и миграции в интиму во время атерогенеза [16]. Исследователи S. Yla-Herttuala и соавт. продемонстрировали, что в стенке артерий кроликов, которых кормили холестериновой диетой, происходит окисление Р-ЛПОНП и ЛПНП, а это, в свою очередь, является важным триггером для активации моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (MCP-1) [17] и экспрессии макрофагального колониестимулирующего фактора во время прогрессирования поражения [18]. Именно на кролике впервые было изучено влияние липопротеинов разного размера на атеросклероз. Например, было отмечено, что при моделировании сахарного диабета (аллоксан- индуцированный сахарный диабет типа I) ингибировалось развитие атеросклероза у кроликов на холестериновой диете [19]. Впоследствии было установлено, что это обусловлено тем, что в плазме кроликов, страдающих диабетом, накапливаются крупные липопротеины, богатые триглицеридами (диаметром> 75 нм), которые не могли проникнуть в стенку артерии [20]. Рассмотренные выше исследования с использованием кроликов, наряду с другими моделями на животных, заложили основу для современной теории атеросклероза: плазменный холестерин является критическим атерогенным фактором (липидная теория развития атеросклероза), а воспалительные клетки, такие как моноциты/макрофаги и Т-лимфоциты (воспалительная гипотеза), а также VCAM-1 и MCP-1 являются ключевыми клеточными и молекулярными компонентами для инициации и прогрессирования атеросклероза [21].
Огромную роль в изучении атеросклероза сыграли наследственные гиперлипидемические кролики Ватанабэ (Watanabe heritable hyperlipidemic, WHHL-кролики) - экспериментальная модель атеросклероза, разработанная японским ученым Yoshio Watanabe [14; 21]. WHHL-кролики позволили сделать важный вклад в установление точной причины семейной гиперхолестеринемии - тяжелого наследственного заболевания, резистентного ко всем гиполипидемическим препаратам и зачастую приводившее к смерти в детском и молодом возрасте от сердечно-сосудистых катастроф (острого инфаркта миокарда, инсульта). Браун и Гольдштейн, обнаружившие генетические мутации, приводившие к дефициту рецепторов липопротеинов низкой плотности (рЛПНП) при семейной гиперхолестеринемии, за свое открытие были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине [22; 23].
Модели атеросклероза с использованием кроликов стали реже использоваться после разработки генетических мышиных моделей благодаря относительной легкости генетических манипуляций (нокаут генов рецептора апопротеина Е, рЛПНП) и относительно короткому времени, необходимому для развития атеросклероза в условиях дефицита рецепторов апопротеина Е и рЛПНП [24]. Несмотря на это, моделирование атеросклероза с использованием кроликов необходимо в области трансляционной медицины для диагностики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Это обстоятельство демонстрируется данными исследований по изучению гиполипидемического действия статинов. Японский ученый A. Endo, открывший статины, поначалу не смог доказать, что компактин (статиновый препарат первого поколения) был эффективным для снижения уровня холестерина в плазме крови у крыс и мышей, независимо от выраженного ингибирования синтеза холестерина в печени [25; 26]. Позже было обнаружено, что грызуны (мыши и крысы) отличаются от людей и кроликов по многим аспектам метаболизма липидов, которые подробнее обсуждаются нами ниже. Например, около 70% холестерина у людей происходит из синтеза in vivo, а остальная часть поступает с пищей, тогда как, у грызунов, напротив, большая часть холестерина экзогенного происхождения, а наименьшая синтезируется в организме [25]. В плазме крови мышей и крыс преобладающим липопротеином является Л11ВП, тогда как у людей и кроликов - ЛИНИ. Способность мышей и крыс образовывать желчную кислоту из холестерина и, соответственно, способствовать снижению холестерина, значительно выше, чем у человека и кроликов [24; 25]. Представленные выше данные свидетельствуют о том, что, несмотря на всю простоту, легкость в обращении и недорогое содержание, мышиные модели атеросклероза менее пригодны для исследований в области трансляционной медицины, нежели моделирование атеросклероза на кроликах. В дальнейшей части статьи мы описываем особенности липидного обмена кроликов, их сходства и различия с обменом липидов у людей, а также отдельно рассматриваем конкретные экспериментальные модели атеросклероза с использованием кроликов.
2. Особенности обмена липидов у кроликов
Кролики являются типичными представителями травоядных животных, и их обычная пища содержит около 15% белка, 40-50% углеводов, 2% растительных жиров и 1525% клетчатки по массе. Содержание холестерина в обычном рационе кроликов составляет менее 0,01%. При таком типе диеты уровни холестерина в плазме крови кроликов находятся в референтом диапазоне 30-90 мг/дл в среднем возрасте 3-16 месяцев [27]. В плазме крови самок кроликов концентрация холестерина выше, чем у самцов кроликов. С возрастом у самцов уровень холестерина уменьшается, тогда как у самок он остается неизменным. Кроме того, уровни холестерина показывают гораздо сильную сезонную изменчивость у самок, чем у самцов, и ниже у беременных и кормящих самок, чем у небеременных, не кормящих самок. Из-за этих особенностей, которые формируются предположительно под влиянием гормонов эстрогенов, самцы кроликов намного чаще используются для исследований в области атеросклероза по сравнению с кроликами противоположного пола [25; 28].