Курсовая работа (т): Особенности апоптоза рабочих кардиомиоцитов млекопитающих

Методы обнаружения апоптоза кардиомиоцитов

Изначально идентификация апоптических клеток базировалась только на морфологическом критерии [17]. Наличие артефактов и субъективная интерпретация признаков снижало достоверность определения апоптоза в несколько раз, поэтому требовались дополнительные методы.

В настоящее время существует большое количество методов выявления апоптоза кардиомиоцитов: электронная микроскопия, метод TUNEL, окраска Annexin V, иммунодетекция эффекторов апоптоза, электрофорез ДНК, различные флуоресцентные ядерные красители. Использование красителей позволяет зарегистрировать морфологические признаки, такие как конденсация и деградация хроматина. Обнаружение формирующихся разрывов ДНК и ее деградации осуществляется методом электрофореза (выявление “лестницы” ДНК). Наличие олигонуклеотидов, встроенных в ДНК через ее свободные концы, формирующиеся в участках разрывов, определяется с помощью таких морфологических методов как TUNEL (TdT-mediated dUTR-biotin nick end-labeling) или ISEL (in situ end-labeling).

Классификацию методов обнаружения апоптоза кардиомиоцитов можно проводить и по времени появления апоптотических изменений в клетке, так Annexin V метод и иммунодетекцию можно отнести к методам выявления ранних признаков апоптоза (появление фосфатидилсерина на поверхности клетки, активация каспаз), а метод TUNEL, электрофорез ДНК, использование флуоресцентных ядерных красителей, электронная микроскопия - к методам выявления более поздних признаков апоптоза (разрывы ДНК и другие повреждения).

Одним из наиболее распространённых методов детекции апоптоза кардиомиоцитов является TUNEL метод, который позволяет выявлять апоптотические клетки с фрагментацией ДНК, у которых еще отсутствуют или слабо выражены морфологические изменения, характерные для апоптоза. Этот метод основан на применении меченого биотином уридинтрифосфата, который связывается со свободными З.'_ОН концевыми группами фрагментов ДНК. Данный метод обладает высокой надежностью только в случае клеток и тканей с низким пролиферативным индексом, поэтому относительно хорошо подходит для кардиомиоцитов. Необходимо учитывать, что метка будет обнаруживаться также на ДНК в процессе ее репарации, и в некротических тканях [35]. Во время апоптоза под действием эндонуклеаз происходят многочисленные разрывы нитей ДНК, в результате чего образуется множество ее 3'_ОН концов. Их присутствие в клетках можно определить при помощи модифицированных нуклеотидов (например, биотин_dUTP) в реакции мечения однонитевых разрывов, катализируемой ДНК_полимеразой или терминальной дезоксинуклеотидтрансферазой (ТдТ). Меченые 3’_ОН концы молекулы ДНК в индивидуальных клетках затем выявляются с помощью авидина, конъюгированного с флуоресцентным красителем. Этот метод использовали в своей работе Л.С. Погодина и соавторы при индукции апоптоза кардиомиоцитов изопротеренолом [6], А.П. Хлапов и соавторы при исследовании роли апоптоза кардиомиоцитов в механизмах ишемического ремоделирования миокарда [14] и многие другие [7,9,11,13]. Т.Э. Владимирская и соавторы при изучении роли апоптоза кардиомиоцитов в развитии ишемической болезни сердца использовали модифицированный TUNEL метод, в котором визуализация меченых моно - и олигонуклеосомных фрагментов ядерной ДНК осуществлялась путём присоединения вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой, и образования иммунокомплексов с субстратом (специальный реагент Cytonin^TM позволял идентифицировать апоптотические кардиомиоциты) [13].

В настоящее время широко распространён цитофлуориметрический метод выявления апоптотических клеток, однако его применение ограничено при использовании срезов ткани после химической фиксации. (Проточная цитофлуориметрия - это процесс, в котором измеряются физические и химические характеристики одиночных клеток или других биологических и небиологических частиц приблизительно одинакового размера, проходящие через оптическую систему в потоке жидкости). Одним из основных методов детекции процессов апоптоза с помощью проточной цитофлуориметрии является использование системы ANNEXIN V - FITC, основанной на совместном использовании аннексина V, аффинного к фосфатидилсерину и иодида пропидия, который проникает в клетки, взаимодействуя с ДНК. Фосфатидилсерин - фосфолипид, который в процессе апоптоза локализуется на клеточной поверхности и формирует один из специфических сигналов для распознавания апоптотической клетки. Различное насыщение клетками двумя красителями позволяет определить живые, некротические и апоптотические клетки. Этот метод использовали Dumont E.A и соавторы для идентификации апоптоза кардиомиоцитов, вызванного ишемией / реперфузией [20].

Электрофорез ДНК для выявления апоптоза кардиомиоцитов использовали в своей работе В.Б.Сапрунова и соавторы (индукция апоптоза в условиях аноксии) [3], H. Fliss и соавторы на моделях ишемии и ишемии с последующей реперфузией [10].

Иммуногистохимический метод, а именно антитела к фосфорилированной форме гистона γ-H2AX, использовали в своей работе Михайлов В.М. и соавторы для регистрации двойных разрывов ДНК (после динамического стресса у нормальных мышей и мышей mdx). Идентификацию апоптоза кардиомиоцитов с помощью антител к каспазе-3 проводили M. Malmberg и соавторы (развитие апоптоза в условиях ишемии с помощью аортального зажима) [11], A. Abbate и соавторы (апоптоз кардиомиоцитов в условиях хронической сердечной недостаточности) [16].

Для определения конденсации и фрагментации хроматина, происходящей при апоптозе, используют флуоресцентные красители: Hoechst, dUTP (deoxyuridine triphosphate), PI (propidium iodide). Например, dUTP и PI применяли G.Olivetti и соавторы при изучении роли апоптоза кардиомиоцитов в развитии ишемической кардиомиопатии у человека.[17]

Для достижения наилучшего результата при идентификации апоптоза кардиомиоцитов используют сразу несколько методов: TUNEL метод и электронная микроскопия [6], электрофорез ДНК и электронная микроскопия [3], TUNEL метод и иммуногистохимия [11].

При интерпретации получаемых результатов следует помнить, что апоптоз является обратимым процессом (до активации каспаз 3, 6, 7), а значит не все клетки, меченные маркерами ранних стадий апоптоза, обязательно погибнут. К примеру, не все кардиомиоциты, аннексин-позитивные и при этом не окрашиваемые пропидий иодидом, а также клетки, окрашиваемые антителами на Fas, обязательно завершат программу апоптоза и погибнут [35].

Морфологические признаки апоптоза кардиомиоцитов

Как неоднократно показано разными группами исследователей, апоптоз кардиомиоцитов (как и других клеток) протекает в две стадии: начальную (медленную) и финальную (быструю). На начальной стадии апоптоза клетка теряет часть цитоплазмы, происходит повреждение ДНК, которое проявляется в конденсации хроматина и появлении инвагинаций ядерной мембраны. Финальная (деструктивная) стадия характеризуется повреждением ядерной оболочки, клеточных мембран, разрушением ядерного содержимого и цитоплазматических органелл [4].

Морфологические признаки ранней стадии апоптоза кардиомиоцитов при использовании соответствующих маркеров видны на электронномикроскопическом уровне, тогда как более поздние апоптотические изменения в структуре кардиомиоцитов можно наблюдать с помощью как электронной, так и световой микроскопии (конденсация хроматина, появление апоптических тел) [21].

●       Уменьшение объёма апоптотической клетки;

●       Инвагинации ядерной оболочки;

Ультраструктура кардиомиоцита левого желудочка крысы после воздействия ИЗП (Погодина и соавторы, 2006)

●       Конденсация хроматина;

●       Изменение структуры и положения митохондрий;

Перемещение митохондрий в кардиомиоците левого желудочка крысы после воздействия ИЗП (Погодина и соавторы, 2006)

●       Фрагментация ядра и цитоплазмы с образованием мелких, окружённых мембраной апоптотических тел;

Апоптотическое тело, окружённое фрагментированной мембраной (E.Arbustini и соавторы, 2008)

●       Фагоцитоз макрофагами апоптотических тел

Поглощение макрофагом апоптотических тел (E.Arbustini и соавторы, 2008)

В работе Михайлова В.М. и соавторов были описаны ультраструктурные особенности ядер начальной и деструктивной стадий апоптоза кардиомиоцитов мышей mdx. По степени выраженности инвагинаций ядерной мембраны и распределения конденсированного хроматина ядра кардиомиоцитов мышей mdx были разделены на три типа: нормальные(13%), полупатологические(55%) и патологические(32%). После стресса доля патологических ядер уменьшилась в 2 раза, что объяснялось исчезновением кардиомиоцитов из-за деструктивных стадий апоптоза [4].

Электронномикроскопическое исследование Погодиной Л.С. и соавторов кардиомиоцитов левого желудочка крыс в периферических зонах очагов некроза показало значительную гетерогенность ультраструктуры кардиомиоцитов (различия в форме и структуре ядер, митохондрий, сократительного аппарата). Все кардиомиоциты были разделены на три типа (прежде всего основываясь на различиях в строении ядер): A (овальные ядра с довольно ровной поверхностью и небольшими ядрышками), B (ядра с многочисленными инвагинациями ядерной оболочки, увеличение конденсации хроматина по всему объёму ядра, крупные ядрышки), С (инвагинация ядерной оболочки и конденсация хроматина сильно выражены, ядрышки меньше, чем в контроле) [6].

Митохондрии играют ключевую роль на начальных стадиях развития апоптоза, поэтому изменения в их структуре является важным морфологическим критерием апоптоза кардиомиоцитов. В работе Погодиной Л.С. и соавторов отмечалось просветление матрикса митохондрий с редукцией крист (наиболее выраженное у кардиомиоцитов С типа), также вытеснение митохондрий из центральных участков клетки на периферию, где они скапливались в многочисленных выступах саркоплазмы («почках») [6].

Михайлов В.М. и соавторы также наблюдали уменьшение электронной плотности митохондрий, к тому же были выявлены митохондрии, содержащие овальные включения (кальций-фосфатной природы), что свидетельствовало о том, что гибель кардиомиоцитов происходила не по типу острого ишемического некроза (для начальной, обратимой стадии которого характерно появление игольчатых включений) [4].

При индукции апоптоза кардиомиоцитов в условиях аноксии Сапрунова В.Б. и соавторы наблюдали гетерогенность популяции митохондрий: основную массу составляли митохондрии с обводнённым, просветлённым матриксом, контрастными мембранами, меньшее количество митохондрий характеризовалось сжатым, уплотнённым матриксом. При продолжительном действии аноксии впервые были выявлены локальные перестройки внутренней мембраны митохондрий с образованием ячеистых упорядоченных структур и необычное расположение мелких электронно-плотных митохондрий внутри более крупных с просветлённым матриксом [3].

Фармакологическая коррекция апоптоза кардиомиоцитов

В настоящее время имеются фармакологические агенты, способные эффективно ингибировать апоптоз кардиомиоцитов, индуцированный различными стимулами: ишемией/реперфузией, H2O2, TNFa и др. Однако эти вещества (ZVAD-fmk, SB 203580, PD 98059, инсулиноподобный ростовой фактор, N-ацетил-цистеин) применяются в основном в экспериментальных условиях [2]. Определённые перспективы связаны с дальнейшим клиническим исследованием карведилола (зарегистрированным фармацевтической фирмой "SmithKleine Beecham Pharmaceuticals" под торговым названием "Coreg(r)"). Препарат представляет собой блокатор β - адренорецепторов с выраженной антиоксидантной и умеренной сосудорасширяющей активностью. В проведенных клинических исследованиях карведилол продемонстрировал значительное снижение уровня смертности у больных с сердечной недостаточностью. Механизмом антиапоптотического действия препарата является подавление экспрессии Fas-рецептора на кардиомиоцитах, ингибирование активации SAPK (stress-activated protein kinase - активируемая при стрессе протеин-киназа) [29]. (Fas-опосредованный путь апоптоза также может быть подавлен введением Hsp70 [31]).

Благоприятный эффект даёт применение ингибиторов каспаз. Так, Thomas A. Holly и соавторы использовали в своём исследовании (кролики, 30 минут ишемия/ 4 часа реперфузия) YVAD-cmk (ацетил-Tyr-Val-Ala-Asp - хлорометилкетон), который подавлял активацию каскада каспаз. В результате зона инфаркта сокращалась приблизительно на 31% [30].

В работе Маншарипова А.Т. и соавторов изучалось влияние мицеллярной формы изосорбида динитрата (как экзогенного донора оксида азота) и прогестерона на развитие апоптоза кардиомиоцитов при модели коронарной недостаточности. Проводилось исследование опытной группы животных (крыс), которые подвергались стрессовому воздействию с одновременным введением мицеллярной формы изосорбида динитрата. Было обнаружено снижение количества апоптотических клеток, уменьшение зоны ишемии по сравнению со стрессовой группой животных, также отмечалось улучшение структуры ткани миокарда. При этом ингибирование апоптотического процесса наблюдалось с седьмого дня применения препарата. Исследование срезов опытной группы животных, которым вводили раствор прогестерона одновременно со стрессовым воздействием, показало, что прогестерон также подавляет апоптотическую гибель кардиомиоцитов (вместе с тем при гистологическом исследовании миокарда отмечалась волнообразная деформация кардиомиоцитов и нарушение структуры миокарда).

Таким образом, в данной работе было показано на фоне иммобилизационного стресса ингибирующее действие мицеллярной формы изосорбида динитрата и прогестерона на апоптотические изменения кардиомиоцитов. Авторы данного исследования предполагают, что механизмы подавления апоптоза связаны со сложным взаимодействием между белками теплового шока, антиапоптотическими белками Bcl_2, различными каспазами и оксидом азота. На основании проведённых экспериментов был сделан вывод, что экзогенный донор оксида азота - мицеллярная форма изосорбида динитрата помимо сосудорасширяющего действия может оказывать ингибирующее действие на апоптоз и уменьшать зону ишемии. Иными словами, данный препарат может быть рекомендован для применения в клинической практике для проведения направленного фармакологического воздействия на развитие апоптотических изменений в миокарде при коронарной болезни сердца и сердечной недостаточности [7].

В последнее время интенсивно изучается возможность применения эритропоэтина (гликопротеинового гормона, регулирующего эритропоэз) в клинической практике [23]. Одним из плейотропных эффектов (лечение анемии, улучшение сердечной функции, нейропротекция) эритропоэтина (ЭПО) и его аналогов (например, РЭПО - рекомбинантный эритропоэтин) является снижение апоптоза кардиомиоцитов при различных заболеваниях сердца (возможно из-за увеличения экспрессии Hsp70 и минимизации NF-kB в миокарде после введения ЭПО).C.J. и соавторы показали, что предварительная обработка ЭПО миобластов, выделенных из сердец крыс, уменьшает перекисный апоптоз приблизительно на 50%, защищает миобласты от повреждения в течение 12 ч аноксии. Также авторы изучали эффект ЭПО in vivo, вводя его кроликам до индуцирования инфаркта миокарда. Через 6 ч после инфаркта в группе ЭПО выявлялось гораздо меньше апоптотических клеток (18.5%), чем в группе контроля, получавшей физиологический раствор (24%). Через 3 дня наблюдалось сокращение зоны инфаркта в группе ЭПО с 35.1% до 13.8% [22].

L. Calvillo и соавторы исследовали культуру кардиомиоцитов крыс и показали, что ЭПО предотвращает апоптоз кардиомиоцитов, подвергнутых 28 часовой гипоксии. При экспериментальном инфаркте миокарда введение РЭПО (5,000 МЕ/кг веса внутрибрюшинно ежедневно в течение 7 дней) уменьшало повреждение кардиомиоцитов на 50% и нормализовало гемодинамику в течение 1 недели после реперфузии [24].

В другом экспериментальном исследовании на крысах (окллюзионная ишемия продолжительностью 45 минут с последующей реперфузией) Lipsic E и соавторы выявили значительное снижение апоптоза кардиомиоцитов на фоне лечения ЭПО (5,000 МЕ/кг) сразу после ишемии (снижение 29%) и после реперфузии (38%) [25].

Кардиопротекторное действие IGF-I (инсулиноподобный фактор роста) изучалось в работе M.Buerke и соавторами на модели ишемии(20 минут)/реперфузии у крыс. Введение этого фактора роста демонстрировало снижение уровня апоптоза кардиомиоцитов с 62% до 28% [26].

В другой работе также на модели ишемии (45 минут) / реперфузии у крыс исследовалось влияние беназеприла (ингибитора ангиотензин-превращающего фермента) на миокард. Было показано, что беназеприл оказывает антиапоптотическое действие, усиливая экспрессию антиапоптотического белка BCL2 и подавляя экспрессию проапоптотического белка BAX [27].