Курсовая работа (т): Особенности апоптоза рабочих кардиомиоцитов млекопитающих

Особенности апоптоза рабочих кардиомиоцитов млекопитающих

Курсовая работа

Особенности апоптоза рабочих кардиомиоцитов млекопитающих

Содержание

Введение

Модели исследования апоптоза кардиомиоцитов

Методы обнаружения апоптоза кардиомиоцитов

Морфологические признаки апоптоза кардиомиоцитов

Фармакологическая коррекция апоптоза кардиомиоцитов

Заключение

Список литературы

Введение

Рабочие кардиомиоциты млекопитающих - это высокодифференцированные, высокоорганизованные клетки, специализированные для выполнения функции сокращения [16]. Кардиомиоциты млекопитающих относят к некамбиальному типу клеточных популяций, что ограничивает регенерационные возможности миокарда. Одной из проблем биологии кардиомиоцитов является их гибель при различных сердечно-сосудистых заболеваниях. В ряде известных к настоящему времени типов гибели клеток [34], безусловно, наиболее изученным остается апоптоз. За последнее время показано, что при многих патологиях сердца, как острых (инфаркт миокарда), так и хронических (сердечная недостаточность) возрастает число кардиомиоцитов с признаками апоптоза [18].

Во многих работах отмечено, что апоптоз - сложный энергозависимый процесс. Это гененетически контролируемый тип клеточной гибели, имеющий отличительные морфологические и биохимические признаки [21]. Апоптоз в норме является одним из важнейших механизмов морфогенеза, антираковой защиты организма, но при этом, в определённых случаях, усиливает тяжёлые поражения организма. В запуске апоптоза участвуют различные органеллы, прежде всего - плазматическая мембрана и митохондрии - органеллы, имеющие особенное значение в функционировании мышечных клеток. Индукция апоптоза и активация проапоптотических белков ведёт к активации каспаз, расщепляющих белки - мишени. В результате происходит разрушение внутриклеточных органелл или их перестройка, фрагментация клетки на апоптотические тельца. Помимо каспазного в последнее время различают некаспазный механизм апоптотической гибели [28], при котором происходит миграция в ядро флавопротеина AIF и эндонуклеазы G, вызывающих распад ядерной ДНК на крупные фрагменты.

Апоптоз кардиомиоцитов довольно редкое событие [17], часто наблюдается вместе с некрозом. При апоптозе, в отличие от некроза, не наблюдается набухания клетки и её органелл, плазматическая мембрана сохраняет свою целостность, не развивается воспалительный процесс. Для идентификации апоптоза кардиомиоцитов применяются различные методы, сравнительный анализ которых является одной из целей данной работы.

Апоптоз может быть индуцирован в кардиомиоцитах в условиях эксперимента (ишемия, стресс, гипоксия и др.) на животных моделях. В клинике при поражениях сердца существует очень мало прямых морфологических доказательств апоптоза кардиомиоцитов, происходящего на всех стадиях инфаркта миокарда, ишемической болезни сердца, несмотря на доступность большинства непрямых доказательств (например, детекция ДНК-фрагментов). Выявление особенностей апоптотической гибели кардиомиоцитов на различных моделях также является целью данной работы.

В настоящее время известно большое число различных фармакологических агентов, способных эффективно ингибировать апоптоз кардиомиоцитов [2,23,27], однако эти вещества пока успешно применяются лишь в экспериментальных условиях. Обсуждение перспектив применения антиапоптотических веществ в клинической практике при лечении сердечно - сосудистых заболеваний занимает важное место в данной работе.

Модели исследования апоптоза кардиомиоцитов

Роль программируемой клеточной гибели в развитии коронарной болезни сердца и ее осложнений, таких как инфаркт миокарда и сердечная недостаточность, привлекает пристальное внимание исследователей [2,7,13]. За последнее время, как на животных, так и у человека получены данные о том, что гибель кардиомиоцитов путём апоптоза играет важную роль при развитии заболеваний сердца.

Модели сердечной недостаточности на животных охватывают большое число видов (крыса, кролик, собака и др.) и условий, в которых проводился эксперимент (ишемия, динамический стресс, аноксия и др.) [1,3,5,6]. Модели можно классифицировать по способам индукции апоптоза, а именно: окклюзия коронарных артерий [2,9,10]; динамический стресс [7]; введение апоптоз-индуцирующих веществ [6]; генетические нарушения [5,8]. Изучение апоптоза, как и других процессов, кардиомиоцитов у человека затруднено, поэтому большинство исследований проводится на животных моделях.

Изучение апоптоза кардиомиоцитов у животных:

. Для сердца взрослых крыс характерно развитие массового послеинфарктного апоптоза кардиомиоцитов, приводящее к гибели организма. Исследование повреждающего действия аноксии в основном проводится на клетках из культуры кардиомиоцитов, а не в системе in situ.

В работе В.Б.Сапруновой и соавторов в качестве модели постинфарктного состояния ткани сердца были использованы изолированные кусочки миокарда, которые инкубировались в условиях аноксии (72 часа). После этого было проведено комплексное исследование ряда параметров: дыхание срезов, ультраструктуры митохондрий и межнуклеосомной фрагментации ДНК. Параллельно, в аэробных условиях, на этой модели были исследованы изменения ультраструктуры митохондрий под влиянием TNF- α. Проведённые исследования продемонстрировали протекание апоптоза в условиях эксперимента (с помощью методов электронной микроскопии, выделения и электрофореза ДНК) [3].

Одной из причин возрастания числа кардиомиоцитов с признаками апоптоза при различных патологиях сердца может быть повышение активности адренергической системы (действие высоких доз катехоламинов усиливает апоптотическую гибель кардиомиоцитов).

Для индукции апоптоза кардиомиоцитов левого желудочка сердца крыс Л.С. Погодина и соавторы использовали синтетический аналог адреналина - изопротеренол (ИЗП), вызывающего развитие «кальциевого» повреждения митохондрий, впоследствии сочетающегося с ишемией кардиомиоцитов из-за усиленного сокращения сердечной мышцы. Для выявления апоптотических кардиомиоцитов применяли метод TUNEL. Было установлено, что в очагах повреждения присутствуют три вида кардиомиоцитов; показано, что апоптоз преобладает в начале развития очага повреждения (4-18 ч), а на более поздних стадиях (24-48 ч) - скорее всего некроз.[6]

Для изучения роли апоптоза в развитии коронарной болезни сердца Маншарипова А.Т. и соавторы использовали экспериментальную модель стресс-индуцированной коронарной недостаточности. В целях моделирования коронарной недостаточности крысы подвергались стрессовому воздействию в виде длительной иммобилизации животных лёжа на спине в течение 8-ми часов ежедневно на протяжении 11-ти дней. Действие стресса выражается в понижении уровня оксида азота в крови и миокарде. Апоптотические кардиомиоциты определялись методом TUNEL. Было показан массивный характер апоптоза при моделировании коронарной недостаточности (с 3 дня); отмечалась прямая зависимость расширения зоны апоптоза от длительности стрессового воздействия [7].

Также у крыс путём окклюзии левой коронарной артерии моделировали необратимую ишемию, затем исследовали потенциально протекторное действие препарата Семакс. Как и при введении Семакса, так и без него при анализе методом TUNEL не наблюдали апоптотических клеток в миокарде после 2 часов 30 минут, однако без введения данного препарата кардиомиоциты имели значительные нарушения основных органелл. Таким образом, Семакс отсрочил появление патологических изменений в ультраструктуре ишемизированных кардиомиоцитов [9].

H. Fliss и соавторы на моделях ишемии (окклюзия левой коронарной артерии, 2, 25 ч) и ишемии (45 мин) с последующей реперфузией (1-4 ч) показали, что как ишемия, так и реперфузия ведут к апоптотической гибели кардиомиоцитов. В отличие от предыдущей работы Buerke M и соавторов на сердце крыс по изучению действия реперфузии на апоптоз (20 мин. ишемия / 24 ч реперфузия) [15], в данном исследовании было замечено, что развитие апоптоза после реперфузии происходит намного быстрее, чем считалось ранее (достаточно 1 ч реперфузии). Апоптоз кардиомиоцитов оценивали с помощью ISEL метода и «лестницы» ДНК в агарозном геле. По данным исследования реперфузия уменьшает область апоптоза в зоне ишемии миокарда, но, в то же время, она способна усиливать остаточный апоптоз, возможно из-за повреждающего эффекта реперфузии (мощная генерация активных форм кислорода).[10]

Модель механического перерастяжения кардиомиоцитов сосочковых мышц сердца крыс описана Cheng с коллегами, при этом выявлено присутствие апоптотических кардиомиоцитов (21%).

2. Можно выделить ряд работ, в которых проводился анализ гибели кардиомиоцитов у мышей с генетическими аномалиями или у трансгенных животных.

Михайлов В.М. и соавторы использовали в своей работе животных с генетическим дефектом - мышей mdx, у которых нарушение синтеза дистрофина в кардиомиоцитах сопровождалось развитием окислительного стресса, вызывающего в свою очередь гибель клеток. У таких мышей, содержащихся в обычных условиях, имелись признаки развивающегося апоптоза, для включения деструктивной стадии апоптоза, в течение которой развивается низкомолекулярный распад ДНК, необходимо усиление окислительного стресса. Нормальных мышей и мышей mdx подвергали динамическому стрессу - плаванию в холодной воде в течение 5 мин. После динамического стресса были описаны ультраструктурные особенности ядер и митохондрий кардиомиоцитов мышей начальной и деструктивной стадий апоптоза [4], исследована динамика появления и исчезновения двойных разрывов в ядрах кардиомиоцитов (использование антител к фосфорилированной форме гистона γ-H2AX) [5].

На модели дилатационной кардиомиопатии - у трансгенных мышей с кардиоспецифической активацией каспазы-8 и стерил-20-подобной киназы-1 млекопитающих было показано, что диффузная гибель кардиомиоцитов может обусловливать развитие сердечной недостаточности в отсутствии каких-либо других причин, снижающих сократительную способность кардиомиоцитов [8].

. На модели ишемии (30 мин) и последующей реперфузии в течение часа сердца у кроликов R.Gottlieb и соавторы показали, что в ответ на реперфузию, но не на ишемию, развивается апоптотическая гибель кардиомиоцитов. Это хорошо согласуется с данными по апоптозу кардиомиоцитов в условиях ишемии на других животных (Fliss). Клиническое значение этих данных состоит в том, что, очевидно, поздняя постинфарктная гибель кардиомиоцитов имеет не некротическую, а апоптотическую природу [2].

. Апоптоз кардиомиоцитов был индуцирован во время открытой операции на сердце свиней, с помощью аортального зажима создавались условия ишемии. Апоптотические кардиомиоциты определялись методами TUNEL и имунногистохимическим путём связывания с каспазой 3. На данной модели было показано, что с увеличением времени пережима аорты (60 - 90 мин.) апоптотическая гибель кардиомиоцитов усиливается [11].

. При использовании метода микроэмболизации коронарных артерий у собак с хронической сердечной недостаточностью с помощью электронной микроскопии и иммуногистохимического исследования было обнаружено, что апоптотический тип клеток был зафиксирован не только на границе очагов инфаркта, но и в отдалённых от них участках миокарда. Однако в зоне некроза общая встречаемость апоптотических клеток вне зависимости от гистохимической принадлежности в 3-4 раза превышала фоновый уровень[1].

На той же модели Гусева и соавторы показали, что ранняя длительная терапия с использованием эналаприла снижает апоптоз кардиомиоцитов [12].

Изучение апоптоза кардиомиоцитов у человека:

Для определения роли апоптоза в гибели кардиомиоцитов при ишемической болезни сердца были исследованы сердца умерших больных, страдавших кардиоваскулярной патологией. Для выявления апоптоза использовали метод TUNEL. В результате было показано, что апоптоз является основной формой гибели кардиомиоцитов при ранней стадии ишемии, при крупноочаговом постинфарктном кардиосклерозе и ишемической болезни сердца с острой или прогрессирующей хронической сердечной недостаточностью [13].

В своей работе G.Olivetti и соавторы использовали образцы миокарда 36 пациентов с хронической сердечной недостаточностью (после трансплантации сердца). Апоптоз кардиомиоцитов оценивали биохимически, гистохимически и путём комбинации гистохимического анализа с конфокальной микроскопией, также в данной работе определяли и экспрессию белков BCL2 и BAX. По результатам исследования уровень апоптоза при хронической сердечной недостаточности составил 77%, что отличается от результатов Narula и соавторов (уровень апоптоза составлял от 5% до 35,5%) [18], однако в обеих указанных работах уровень апоптических клеток в миокарде был очень высоким. Также в данном исследовании было показано, что число кардиомиоцитов меченых на белок BCL2 (антиапоптотическая активность) превышало в 1,8 раз контрольный образец, тогда как уровень экспрессии белка BAX оставался постоянным. Таким образом, было показано развитие апоптоза кардиомиоцитов в декомпенсированном сердце человека, несмотря на усилении экспрессии BCL2 [17]..Allat и соавторы изучали развитие аритмогенной дисплазии правого желудочка, которая характеризуются интенсивным замещением кардиомиоцитов волокнистой тканью. Было показано, что гибель кардиомиоцитов при этом заболевании происходит путём апоптоза (метод TUNEL) [19].

Хлапов А.П. и соавторы исследовали роль апоптоза кардиомиоцитов в механизмах ишемического ремоделирования миокарда. Материалом исследования являлись биоптаты миокарда левого желудочка, полученные интраоперационно у пациентов с ишемической болезнью сердца и хронической сердечной недостаточностью. Для оценки роли апоптоза кардиомиоцитов в развитии хронической сердечной недостаточности пациенты были разделены на три клинические группы с учетом величин конечного диастолического объема: I группа - менее 120 мл, II - от 120 до 150 мл, III группа - более 150 мл. Показано, что наибольшая встречаемость TUNEL-ядер кардиомиоцитов характерна для I и II клинических групп (0,65 и 0,58 соответственно), то есть была установлена существенная значимость апоптоза кардиомиоцитов на ранних этапах ремоделирования левого желудочка. Таким образом, максимальная эффективность лечебных мероприятий, направленных на терапию ишемического ремоделирования миокарда, может наблюдаться лишь на ранних стадиях заболевания. На более поздних стадиях терапия, направленная на управление апоптозом, может оказаться малоэффективной [14].

В работе A. Abbate и соавторов было показано, что у пациентов умерших (за период ≥10 дней) после острого инфаркта миокарда постинфарктное ремоделирование миокарда левого желудочка и развитие сердечной недостаточности было связано с апоптозом кардиомиоцитов, причём постинфарктное развитие сердечной недостаточности коррелировало с возросшим приблизительно в 4 раза апоптозом (с 6, 4% до 26, 2%) в области инфаркта. Кроме того апоптоз кардиомиоцитов как в области инфаркта, так и в непоражённых участках усиливал ремоделирование миокарда левого желудочка. Для определения апоптоза кардиомиоцитов использовали метод TUNEL и иммуногистохимический (антитела к каспазе-3) [16].