Автореферат: Морфобиохимический состав крови и естественная резистентность животных при нагрузке организма биологически активной добавкой на основе спирулины

Кровь для биохимических исследований брали из ушной вены поросят, стабилизировали гепарином для определения гемоглобина. С целью получения сыворотки кровь центрифугировали. При этом определяли: общее количество эритроцитов и лейкоцитов в счетной камере Горяева по методу В.И. Георгиевского (1976); лейкоцитарную формулу путем подсчета форменных элементов белой крови в мазках, окрашенных по Романовскому - Гимзе; количество гемоглобина - гемоглобинцианидным методом по Кудрявцеву А.А. (2009); содержание общего белка - спектрофотометрическим методом (Антонов Б.И.,1991); количественное содержание альбуминов и глобулинов определяли в аппарате вертикального гель - электрофореза АВГЭ-2 при использовании агарового геля; содержание глюкозы - по методам, описанным в руководстве Антонова Б.И. (1991), мочевины - кинетическим методом (глутаматдегидрогеназным методом), креатинина - кинетическим методом, который основан на цветной реакции Яффе, остаточного азота - колориметрическим методом с реактивом Несслера, активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз - ультрафиолетовым методом (Райтмана-Френкеля).

Бактерицидную активность сыворотки крови (БАСК) определяли по методу О.В. Смирновой и Т.А. Кузьминой (1966), с использованием E. coli в качестве тест - культуры.

Фагоцитарную активность (ФА) определяли с использованием взвеси сальмонелл по описанию А.С. Лабинской (1978).

Фагоцитарный индекс - в НСТ - тесте по методу Stuart, Loc в модификации Б.С. Нагаева (1983), описанный в руководстве А.С. Козлюк с соавт. (1987)

Лизоцимную активность сыворотки крови определяли по методу В.Т. Дорофейчука (1968).

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Общие свойства и химический состав спирулины

Спирулина - простейшая сине - зеленая водоросль, состоящая из нитей - трихомов, имеет S- образную форму. Спирулина способна к фототаксису, т.е. перемещается параллельно лучам света и меняет скорость движения в зависимости от интенсивности.

В таблице 1 описаны состав питательных веществ и основные физические свойства спирулины, производимой ООО «Неофит» г. Самара. Суспензия спирулины содержит в своем составе в среднем 24,52 г сухого вещества в одном литре.

Таблица 1 - Физические свойства и состав питательных веществ высушенной спирулины (n=5)

Микроводоросль в высушенном виде представляет собой мелкодисперсный сыпучий порошок зеленого цвета с характерным запахом водоросли.

Основной составной частью спирулины является белок. Спирулина в своём составе содержит около 62% сырого протеина. Белок является основной составной частью всего живого и его дефицит приводит к снижению продуктивности и увеличению затрат кормов в рационе сельскохозяйственных животных. Исследования показали, что с возрастом культуры содержание белка в ней уменьшается.

Достаточно высокий процент в содержании спирулины составляют углеводы (14,9%) - это основной энергетический материал для живых организмов.

Жиры составляют 4,1% в структуре спирулины и обладают высокой энергетической ценностью. Они обладают энергетической и пластической функцией для живых организмов; обеспечивают дыхание, кровообращение, нервную регуляцию, а также служат для построения тканей и органов.

Количество клетчатки достаточно низкое - всего 3,2%; содержание золы - 6,2%. В сравнении с литературными данными [Берестов В.А.. 2003, Гамко Л.Н.. 2000] существенных различий не выявлено.

По химическому составу спирулина отличается высоким содержанием различных составляющих. В своих исследованиях мы изучали минеральный и витаминный состав спирулины. При этом было выяснено, что спирулина является богатым источником минералов (кальций, фосфор, натрий, магний, железо, цинк, сера, медь) и витаминов (Е, группы В, каротин).

3.2 Биологические особенности и химический состав амаранта.

Амарант - достаточно новая для России культура, характеризующаяся высокой урожайностью, богатым и сбалансированным белком, повышенным содержанием витаминов и минеральных веществ. Это растение занимает ведущее положение не только в качестве продовольственной и кормовой, но и лекарственной культуры. В данной работе мы исследовали продукт переработки семян амаранта после получения из них масла - шрот семян амаранта, полученный в ПНИИС им.Н.П. Константинова путем сверхкритической флюидной экстракции диоксидом углерода (СФЭ - CO2). Полученные в результате исследования данные представили в таблице 2.

Таблица 2 - Общие свойства и состав питательных веществ шрота семян амаранта в исследуемых образцах

Из таблицы 2 следует, что шрот из семян амаранта является источником протеина (29,1 %), сахара (18,0 %) жира (13,7 %) и клетчатки (24,5 %).

Также мы исследовали химический состав шрота амаранта и выяснили, что он богат минеральными веществами - калием, кальцием, магнием, фосфором, кремнием, железом, а также содержит бор и марганец.

3.3 Общие свойства и химический состав смеси спирулины и шрота семян амаранта

Таким образом, разработанная нами смесь спирулины и шрота семян амаранта представляет собой мелкодисперстный сыпучий порошок, зелено-коричневого цвета, в среднем содержит 45,5% протеина, 16,5% сахара, 13,8% клетчатки, 6,2% золы, 9% жиров, 9% воды, витамины группы В (В1, В2, В3), Е, каротин. По химическому составу смесь богата макро- и микроэлементами: в среднем содержит кальция - 1953 мг/кг, фосфора - 5559 мг/кг, железа 288 мг/кг, натрия - 1650 мг/кг, магния - 2216 мг/кг, цинка - 59,3 мг/кг, калия - 6336 мг/кг,меди - 14,9мг/кг, хрома 2,36 мг/кг, никеля - 1,32 мг/кг, серы - 1,46 мг/кг, бора - 4,7мг/кг, марганца - 1,81 мг/кг.

3.4 Общая реакция организма крыс в ответ на введение различных доз биологически активной добавки на основе спирулины и шрота семян амаранта

После внутрижелудочного введения смеси спирулины и шрота амаранта в дозах 1000-5000 мг/кг общее поведение крыс не отличалось от контрольной группы, они свободно двигались по клетке, охотно принимали корм и адекватно реагировали на действие раздражителей (звук, уколы, зажим кончика хвоста пинцетом). На дозы 7500-10000 мг/кг отвечали некоторым угнетенным состоянием в течение 25-35 мин после введения смеси. В этот период они, по сравнению с контрольными, меньше двигались по клетке, отказывались от корма и воды. Ответная реакция на действие внешних раздражителей сохранялась. Через 35-45 минут их поведение было сходным с поведением контрольных животных. За период наблюдения ни одно животное ни в контроле, ни в опытных группах не погибло. Следовательно смесь, состоящая из равного количества по весу спирулины и шрота амаранта малотоксична для теплокровных животных.

3.5 Определение оптимального сочетания спирулины и шрота амаранта

Для определения влияния шрота амаранта, спирулины и их комбинации на общеклинические показатели крови нами был построен ортогональный центральный композиционный план, в котором в качестве независимых переменных использовались различные дозы спирулины и шрота амаранта в количестве (0, 15 и 30 мг). Исследования проводили на белых крысах-самцах массой 200-250 г, которых содержали на стандартном рационе вивария. Было проведено 9 опытов. Результаты исследования представлены на рисунках 1-3.

В первом опыте животные получали воду очищенную, показатели Hb, Er, Le были достаточно низкими. Во втором опыте животные получали 15 мг спирулины, показатели крови практически не изменились. При добавлении в рацион шрота семян амаранта было отмечено некоторое увеличение этих показателей. При увеличении дозы смеси спирулины и шрота амаранта, от 15 до 30 мг, отмечалось значительное увеличение показателей Hb, Er, Le. При дальнейшем увеличении дозы комбинации данных веществ (30мг и более) уровни основных показателей крови варьировались слабо. Также в опытах нами исследовались показатели лейкоформулы и СОЭ, колебания этих величин были в пределах ошибки опыта.

На основе опытных данных были построены поверхности отклика (рис.1):

Рис. 1. Влияние различных доз спирулины и шрота семян амаранта на уровень гемоглобина.

На рис. 2 наглядно показано значительное увеличение гемоглобина крыс (на 17%) при добавлении в рацион комбинации спирулины и шрота амаранта в дозе с 20 до 30 мг. Гемоглобин - важный элемент системы крови живых организмов, который участвует в транспортировке дыхательных газов крови.

Рис. 2. Влияние различных доз спирулины и шрота семян амаранта на количество эритроцитов.

Экспериментальные данные показывают, что ответная реакция в виде увеличения количества эритроцитов (на 30%), в пределах физиологической нормы, отмечалась при увеличении дозы комбинации данных веществ до 20мг (рис. 3). Дальнейшее увеличение дозы до 30мг не вызывало значительных колебаний количества эритроцитов.

Рис. 3. Влияние различных доз спирулины и шрота семян амаранта на уровень лейкоцитов крови.

На рисунке 3 показано достоверное увеличение, находящееся в пределах физиологической нормы, числа лейкоцитов крови (на 39%). Согласно полученным результатам поверхности отклика, наиболее эффективной оказалась комбинация спирулины и шрота амаранта в соотношении 1:1, в дозе 40 мг, которая была самой благоприятной для этих трех параметров.

3.6 Результаты морфологического и биохимического состава крови при длительном введении смеси спирулины и шрота семян амаранта в дозе 1000мг/кг

В связи с тем, что предполагалась разработка методов применения смеси продуктивным животным, предварительно изучены морфологический и биохимический состав крови крыс при ежедневном, в течение 30 дней, внутрижелудочном введении смеси белым крысам. Масса тела у крыс в обеих группах была примерно одинаковой, колебания её были не достоверными. Поведение и состояние животных опытной группы не отличались от контрольной. Сохранялась их активность, прием воды и пищи без особенностей, естественные отправления в норме. Отрицательного влияния на ЦНС данной композиции не отмечалось.

В таблице 3 приведены результаты опыта по влиянию биологически активной добавки на основе спирулины на биохимические показатели крови крыс.

Таблица 3 - Влияние комбинации спирулины и шрота семян амаранта на биохимические показатели крови (n=10, M±m)

Примечание ** - p <0,01 по сравнению с контролем

Данные таблицы 3 указывают, что введение комбинации спирулины и шрота семян амаранта в дозе 1000 мг/кг в течение 15 и 30 суток не оказывает отрицательного влияния на биохимические показатели крови. Через 45 суток от начала введения БАД, отмечается некоторое снижение (на 13%) липидов крови по сравнению с контролем и повышение уровня общего белка на 9,8%. Таким образом, данная композиция не оказывает гепатотоксичного действия, обладает антиоксидантной активностью.