Вся методика базируется на способности нуклеиновых кислот к самостоятельной репликации, что в данном случае проводится искусственно в условиях лаборатории. Воспроизведение ДНК может начаться не в любой области молекулы, а только в участках с определенной последовательностью нуклеотидов - стартовых фрагментах. Для того чтобы полимеразная цепная реакция началась, нужны праймеры (или ДНК-зонды). Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо соблюдение ряда условий:
Наличие в реакционной смеси ряда компонентов:
Праймеры - олигонуклеотид, выполняющий роль затравки и инициирующий синтез полинуклеотидной цепи на ДНК- или РНК-матрице. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы. полимераза - термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание 3’-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности.
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфат (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфат (дТТФ) - "строительный материал", используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК;
Буфер - смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающих оптимальные условия для реакции, и стабильное значение рН;
Анализируемый образец - подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, служащую мишенью для последующего многократного копирования (например, ДНК микроорганизмов) [14].
Циклический температурный режим:
Ход реакции: обычно при проведении ПЦР выполняется 20-35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий:
. Денатурация. На первом этапе необходимо денатурировать ДНК, находящуюся в образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95° С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул. Этот процесс длится не менее 1 минуты.
. Отжиг. На втором этапе температуру смеси понижают до 55°С праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Праймеры выбирают так, что они ограничивают искомый фрагмент и комплементарны противоположным цепям ДНК.
Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа.
. Элонгация (синтез). На третьем этапе температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы - 75°С, и начинается синтез комплементарной цепи ДНК, инициируемый 3’-гидроксильной группой праймера, с максимальной эффективностью.
Все реакции проводят в пробирках, погруженных в термостат. Смена температурного режима и его поддержание осуществляется автоматически.
Первый цикл. ДНК-мишень фланкирована определенными последовательностями. К образцу ДНК добавляют праймеры (Р1 и Р2), ДНК-полимеразу Tag и четыре дНТФ. Здесь каждая из новосинтезированных цепей имеет гораздо большую длину, чем расстояние от 3’-гидроксильной группы "её" праймера до концевого нуклеотида последовательности, комплементарной второму праймеру.
Во втором цикле двухцепочечную ДНК, состоящую из исходной и новосинтезированной ("длинная матрица") цепей, вновь денатурируют, а затем отжигают с праймерами [13].
В третьем цикле все гетеродуплуксы, образовавшиеся ранее, одновременно подвергаются денатурации и отжигу с праймерами, а затем реплецируются. При отжиге праймеры гибридизуются с комплементарными участками исходных цепей, а также "длинных" и "коротких" матриц.
В последующих циклах число "коротких матриц" становится все больше.
Таким образом, специфические фрагменты, ограниченные на концах праймерами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации.
Эффект «плато»
Используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации. В зависимости от условий и количества циклов реакции амплификации, на момент достижения эффекта “плато” влияют утилизация субстратов (дНТФ и праймеров), стабильность реактантов (дНТФ и фермента) и др.
Стадии постановки ПЦР:
Подготовка пробы биологического материала
Амплификация
Приборное обеспечение
Детекция молекул РНК
Оценка результатов реакции
Метод горизонтального электрофореза
Метод вертикального электрофореза
Метод гибридизационных зондов
Контроль за прохождением реакции амплификации
[12]
Глава 2. Онкомаркеры в клинической диагностике
Онкозаболевания как причина смертности стоят на втором месте после сердечно-сосудистой патологии. Среди злокачественных новообразований наиболее часто встречаются: рак легкого - 27%, рак молочной железы - 18%, колоректальные опухоли - 12%. Затраты на лечения таких больных могут неоправданно возрастать за счет несвоевременной диагностики (в основном позднего выявления в неоперабельных стадиях) и отсутствия послеоперационного мониторинга эффективности операции и химиотерапии [17].
Определение осуществляется двухэтапным методом (обратная транскрипция + ПЦР в реальном времени). В настоящий момент разработаны наборы для определения следующих РНК-онкомаркеров. А также определением в крови онкомаркеров методами иммуноферментного (ИФА), иммунолюминесцентного (ИЛА) радиоиммунного (РИА) анализа.
Онкомаркеры - это специфические белки, продуцируемые опухолевыми клетками, содержание которых в крови коррелирует с наличием или прогрессирующим ростом злокачественной опухоли. В настоящее время нет "идеального" маркера со 100% специфичностью (т.е. не обнаруживающегося у здоровых) и 100% чувствительностью (т.е. обязательно выявляемого у всех больных даже в начальной стадии рака).
Поэтому они ни в коем случае не должны определяться при массовых обследованиях бессимптомных пациентов в качестве скрининга на выявление злокачественного роста. Тем не менее, существуют маркеры с достаточно высокими специфичностью и чувствительностью, позволяющие применять их и для первичной диагностики в группах риска или у имеющих симптоматику рака пациентов [15].
Ценность цитологических методов диагностики рака не подлежит сомнению, но в 10 - 20% случаев биопсий не удается получить материал, содержащий опухолевые клетки при наличии злокачественной опухоли. Недоступность ЯМР-томографии как массового метода диагностики для большинства пациентов в России не позволяет визуализировать опухоли внутренних органов и метастазы размером до 0.5 - 1см. В таких случаях только определение онкомаркеров дает возможность решить диагностические проблемы, особенно при определении их в динамике: прирост уровня онкомаркера за 1 - 2 месяца вдвое даже при исходно нормальном уровне - верный признак роста опухоли.
Альфа-фетопротеин (АФП) в сыворотке
Содержание АФП в сыворотке в норме:
у взрослых - до 10 МЕ/мл;
у беременных с 8 нед. его содержание повышается и составляет во II - III триместре 28 - 120 МЕ/мл;
АФП - онкомаркер, гликопротеин, вырабатываемый желточным мешком эмбриона. Время полужизни 7 сут.
АФП как онкомаркер имеет следующее клиническое применение:
для выявления и мониторинга первичной гепатоцеллюлярной карциномы, которая возникает, как правило, в цирротической печени;
для выявления тератобластомы яичка .
для оценки эффективности терапии этих заболеваний.
Повышенный уровень АФП определяется у 9% пациентов с метастатическим поражением печени при злокачественных опухолях молочной железы, бронхов и колоректальной карциноме, при гепатитах различной этиологии (повышение при этом носит временный характер).
Определение содержания АФП в сыворотке применяют:
для диагностики и мониторинга лечения гепатоцеллюлярного рака;
для диагностики герминогенных опухолей;
для диагностики метастазов любой опухоли в печень;
для скрининга в группе высокого риска (цирроз печени, гепатит, дефицит α1-антитрипсина);
для пренатальной диагностики (пороки развития нервного канала, синдром Дауна у плода);
для оценки степени зрелости плода [20].
Раково-эмбриональный антиген (РЭА) в сыворотке
Содержание РЭА в сыворотке:
в норме составляет 0 - 5 нг/мл;
у страдающих алкоголизмом - 7 - 10 нг/мл;
у курящих - 5 - 10 нг/мл.
РЭА - гликопротеин, формируемый при эмбриональном развитии в желудочно-кишечном тракте. На уровень РЭА влияют курение и в меньшей степени прием алкоголя. Небольшое повышение уровня РЭА наблюдается у 20 - 50% больных с доброкачественными заболеваниями кишечника, поджелудочной железы, печени и легких. Основное применение РЭА - мониторинг развития заболевания и эффективности терапии у больных с колоректальной карциномой. Чувствительность теста составляет при:
колоноректальном раке - 50% при концентрации более 7,0 нг/мл;
раке печени - 33% при концентрации более 7,0 нг/мл;
раке молочной железы - 28% при концентрации более 4,2 нг/мл;
раке желудка - 27% при концентрации более 7,0 нг/мл;
раке легких - 22% при концентрации более 7,4 нг/мл.
Уровень РЭА в сыворотке крови больных раком толстой кишки коррелирует со стадией заболевания и служит показателем эффективности оперативного вмешательства, химио- и лучевой терапии. РЭА может использоваться в качестве раннего индикатора рецидивов и метастазов [17].
Повышенный уровень РЭА выявляется у 30 - 50% больных раком молочной железы, у 33 - 36% больных раком легкого. Уровень РЭА может повыситься при хронических заболеваниях легких, аутоиммунных заболеваниях, но после выздоровления этот уровень нормализуется.
Содержание РЭА в сыворотке:
мониторинг течения и лечения рака прямой кишки (повышение концентрации до 20 нг/мл - диагностический признак злокачественных опухолей различной локализации);
мониторинг опухолей желудочно-кишечного тракта, опухолей легких, опухолей молочной железы;
ранняя диагностика рецидивов и метастазов рака;
мониторинг в группах риска (цирроз, гепатит, панкреатит).
Карбогидратный антиген СА-19-9 в сыворотке
Содержание СА-19-9 в сыворотке в норме - до 37 МЕ/мл.
СА-19-9 - гликопротеин, обнаруживаемый в фетальном эпителии поджелудочной железы, желудка, печени, тонкой и толстой кишки, легких. СА-19-9 выводится исключительно с желчью, поэтому даже незначительный холестаз может быть причиной значительного повышения его уровня в крови. Повышение концентрации СА-19-9 может наблюдаться также при доброкачественных и воспалительных заболеваниях желудочно-кишечного тракта и печени (до 100 и даже 500 МЕ/мл), при муковисцидозе. Как онкомаркер СА-19-9 имеет чувствительность 82% в случае карциномы поджелудочной железы.
СА-19-9 имеет чувствительность от 50 до 75% при гепатобилиарной карциноме. В настоящее время СА-19-9 является вторым по значимости маркером (после РЭА) для диагностики карциномы желудка. Его повышение наблюдается у 42 - 62% больных раком желудка [18].
Чувствительность СА-19-9 составляет:
у больных раком поджелудочной железы - 82% при Cut-off более 80 МЕ/мл;
у больных раком печени - 76% при Cut-off более 80 МЕ/мл;
у больных раком желудка - 29% при Cut-off более 100 МЕ/мл;
у больных колоноректальным раком - 25% при Cut-off более. 80 МЕ/мл.
Определение содержания СА-19-9 в сыворотке применяют:
для диагностики и мониторинга лечения рака поджелудочной железы;
для раннего обнаружения метастазирования опухоли поджелудочной железы;
для мониторинга рака толстой кишки, желудка, желчного пузыря и желчных протоков.
Муциноподобный ассоциированный антиген (МСА) в сыворотке
Содержание МСА в сыворотке в норме составляет до 11 МЕ/мл.
МСА - опухолеассоциированный антиген, присутствующий в клетках молочной железы. Представляет собой сывороточный муцин-гликопротеид. Концентрация МСА в сыворотке увеличивается при раке молочной железы и у 20% больных с доброкачественными заболеваниями молочной железы. МСА применяют для мониторинга течения карциномы молочной железы. При уровне Cut-off 11 МЕ/мл МСА имеет специфичность 84% и чувствительность до 80% в зависимости от клинической стадии опухоли. При сочетании его определения с другими маркерами чувствительность не повышается. Исследование МСА применяют для мониторинга эффективности оперативного, химио- и лучевого лечения рака молочной железы [31].
Содержание МСА в сыворотке:
мониторинг больных раком молочной железы;
диагностика отдаленных метастазов рака молочной железы [17].
Раковый антиген СА-125 в сыворотке
Содержание СА-125 в сыворотке в норме у здоровых лиц составляет до 35 МЕ/мл; при беременности сроком 1 - 2 нед - до 100 МЕ/мл.
СА-125 - гликопротеин, присутствующий в серозных оболочках и тканях. Концентрация антигена повышается при заболеваниях этих тканей, беременности и менструации. Значительное увеличение уровня СА-125 в крови наблюдается иногда при различных доброкачественных гинекологических опухолях, а также при воспалительных процессах, вовлекающих придатки. Незначительный подъем уровня этого маркера выявляется также в I триместре беременности, при различных аутоиммунных заболеваниях, гепатите, хроническом панкреатите и циррозе печени. Применяют главным образом для мониторинга рака яичников и диагностики его рецидивов. При уровне Cut-off 65 МЕ/мл СА-125 имеет чувствительность до 87% в зависимости от стадии и гистологического типа опухоли. У 83% больных раком яичника его уровень составляет в среднем 124 - 164 МЕ/мл.
Опухоли желудочно-кишечного тракта, карцинома бронхов и карцинома молочной железы могут также в некоторых случаях быть причиной значительного подъема уровня СА-125.
Определение содержания СА-125 в сыворотке применяют:
для диагностики рецидивов рака яичника;
для мониторинга лечения и контроль течения рака яичников;
для диагностики новообразований родовых путей, брюшины, плевры;
для диагностики серозного выпота в полости (перитонит, плеврит);
для диагностики эндометриоза[17].
Карбогидратный антиген СА-72-4 в сыворотке
Содержание СА-72-4 в сыворотке в норме у здоровых лиц составляет 0 - 4,0 МЕ/мл.
СА-72-4 - муциноподобный опухолеассоциированный антиген метастазирующих опухолевых клеток. Повышение его концентрации характерно для рака желудка, яичников и легких. Особенно высокая концентрация в крови определяется при карциноме желудка. При уровне Cut-off 3 МЕ/мл СА-72-4 имеет специфичность 100% и предельную чувствительность 48 для карциномы желудка при дифференциации ее с доброкачественными желудочно-кишечными заболеваниями. СА-72-4 является полезным маркером для мониторинга течения заболевания и эффективности терапии при карциноме желудка. Определение СА-72-4 имеет особое значение при слизеобразующей карциноме яичника. Повышенный уровень СА-72-4 изредка обнаруживается при доброкачественных и воспалительных процессах.
Определение содержания СА-72-4 в сыворотке применяют:
для мониторинга бронхогенного немелкоклеточного рака легкого;
для мониторинга лечения и контроль течения рака желудка;
для диагностики рецидивов рака желудка;
для мониторинга лечения и контроль течения муцинозного рака яичника [28].
Раковый антиген СА-15-3 в сыворотке
Содержание СА-15-3 в сыворотке в норме у здоровых лиц составляет до 27 МЕ/мл; в III триместре беременности - до 40 МЕ/мл.
Определение концентрации СА-15-3 используют для мониторинга лечения и диагностики рецидивов рака молочной железы и легких [28].