Курсовая работа
Методы ПЦР в диагностике онкологических заболеваний
Содержание
Обозначения и сокращения
Введение
Глава 1. Сущность и Принципы метода ПЦР
1.1 Применение метода ПЦР
1.2 Достоинства и недостатки метода ПЦР
1.3 Разновидности ПЦР
1.4 Mеханизмы ПЦР. Стадии постановки ПЦР
Глава 2. Онкомаркеры в клинической диагностике
2.1 Алгоритм исследования на онкомаркеры
Заключение
Список
использованных источников
Обозначения и сокращения
ПЦР - Полимеразная цепная реакция;
УПФ - условно-патогенная флора;
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;
дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат ;
дЦТФ - дезоксицитозинтрифосфат ;
дТТФ - дезокситимидинтрифосфат ;
ИФА - иммуноферментный ;
ИЛА - иммунолюминесцентный ;
РИА - радиоиммунный ;
ЯМР - ядерный магнитный резонанс;
АФП - альфа-фетопротеин;
РЭА - раково-эмбриональный антиген;
СА - раковый антиген;
МСА - муциноподобный ассоциированный антиген;
β-ХГ - Бета-хорионический гонадотропин;- антиген плоскоклеточной карциномы ;
ПСА - Простатический специфический антиген;
сПСА - Свободный простатический специфический антиген;- Нейронспецифическая енолаза;- Фрагмент цитокератина;
ВТА - Опухолевый антиген мочевого пузыря;
ОМ
- онкомаркер ;- международная классификация стадий злокачественных
новообразований.
Введение
Достижения генетики и молекулярной биологии последних десятилетий оказали огромное влияние на понимание природы инициализации и прогрессии злокачественных образований. Окончательно установлено, что рак представляет собой гетерогенную группу заболеваний, каждое из которых вызывается комплексом генетических нарушений, определяющих свойство неконтролируемого роста и способность к метастазированию. Эти современные знания открыли принципиально новые возможности в диагностике и лечении злокачественных новообразований [1].
ДНК-диагностика - это один из наиболее современных высокотехнологичных методов исследования. ДНК-анализы широко применяются в диагностике инфекционных заболеваний, позволяя обнаруживать даже единичные микроорганизмы в организме человека [10].
ДНК-диагностика объединяет несколько методов исследования, самый распространенный из них - метод ПЦР (полимеразной цепной реакции, Polymerase chain reaction, PCR diagnostics) [6] .
Изобретение ПЦР К.Муллисом и его сотрудниками в 1985 году революционизировало молекулярную биологию и молекулярную медицину. До этого в истории медицины врачи не имели такого быстрого, эффективного, и главное высокоточного метода ранней диагностики различных заболеваний. Данный метод широко распространен в современном мире, имеет большое количество достоинств и обладает высокой точностью. Широкое внедрение в область практического здравоохранения ПЦР обусловлено простотой ее выполнения, низкой себестоимостью и надежностью. Вместе с тем, сегодня уже очевидно, что дальнейшее развитие ПЦР получит в области количественного определения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) инфекционных агентов [5].
Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR - polymerase chain reaction) - современный метод клинической лабораторной диагностики, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул. Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в условиях in vitro. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований. Прежде можно было получить только минимальные количества специфического гена, теперь с использованием ПЦР даже единичная копия может быть амплифицирована до миллиона копий за несколько часов [7].
Методика ПЦР стала необходимой для многих обычных процедур, таких как клонирование специфических фрагментов ДНК, выявление и идентификация генов в диагностике и в судебной медицине, а также в процессе изучения характера экспрессии генов. В последнее время метод ПЦР позволил проводить исследования в новых областях, таких как контроль аутентичности пищевых продуктов, анализ наличия генетически модифицированной ДНК или микробиологического заражения [3].
Существует большое количество способов получить данные о концентрации нуклеиновых кислот в пробе методом ПЦР, но все они требуют дополнительных трудоемких этапов работы, связанных с предварительной раститровкой выделенной из анализируемой пробы ДНК, или полученных в ходе ПЦР ампликонов, что приводит к увеличению времени, необходимого для постановки анализа и сложности интерпретации полученных результатов. Также, наличие дополнительных этапов работы увеличивает вероятность ошибки и получения недостоверного результата.
Актуальность данной темы заключается в том, что метод ПЦР ориентирован на предупреждение распространения и ликвидацию инфекций, диагностики наследственных, онкологических и других заболеваний [12].
Предмет исследования - онкомаркеры, используемые для диагностики онкологических заболеваний .
Целью данного исследования является обзор и систематизация научной и специальной литературы по методам ПЦР в диагностике онкологических заболеваний.
Задачи исследования:
Обзор и обобщение научной литературы об основных принципах ПЦР;
Систематизировать данные литературы об основных онкомаркерах в диагностике методом ПЦР.
Провести анализ данных литературы о перспективах
применения метода ПЦР в диагностике онкологических заболеваний.
Глава 1. Сущность и принципы метода ПЦР
Метод ПЦР основан на механизме репликации ДНК in vivo: двухцепочечная ДНК (dsДHK) раскручивается до одноцепочечных ДНК (ssДHK), дуплицируется и снова закручивается. Эта методика состоит из повторяющихся циклов:
• Денатурация ДНК путем плавления при повышенной температуре для превращения двухцепочечной ДНК в одноцепочечную ДНК
• Отжиг (гибридизация) двух олигонуклеотидов, используемых в качестве праймеров для целевой ДНК
• Удлинение цепи ДНК, начиная от праймеров, путем добавления нуклеотидов с использованием ДНК полимеразы в качестве катализатора и в присутствии ионов Мg2+ .
Достоинство метода заключается в его универсальности: ПЦР позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК, даже когда бессильны другие методы. Оборудование, используемое для ПЦР, стандартно, оно не зависит от того, что именно и где именно мы ищем [8].
Следующий плюс - высокая специфичность. В
материале, направленном на исследование, определяется уникальная
последовательность нуклеотидов, характерная только для конкретного возбудителя.
Таким образом, можно говорить, что специфичность метода достигает 100%. Кроме
того, это позволяет одновременно, в одном и том же материале, проводить поиск
нескольких возбудителей без какого-либо ущерба для качества ответа [8,9].
.1 Применение метода ПЦР
Результатом открытия ПЦР стало почти немедленное практическое применение метода. Перспективы практического использования ПЦР-диагностики . В настоящее время наиболее быстро развиваются пять основных направлений генодиагностики:
диагностика инфекционных заболеваний;
диагностика онкологических заболеваний;
диагностика лейкемий и лимфом;
диагностика рака груди;
диагностика других злокачественных заболеваний;
диагностика генетических заболеваний;
идентификация личности;
судебная медицина, криминалистика;
трансплантация органов и тканей;
определение отцовства;
диагностика патогенов в пище.
В медицине ПЦР применяют при диагностике инфекционных и наследственных заболеваний (метод ПЦР позволяет обнаружить единственную копию чужеродной ДНК в образце),при диагностике рака и иммунных патологий. ПЦР используют для идентификации личности и определения биологического родства индивидов [12].
.2 Достоинства и недостатки метода ПЦР
Процесс ПЦР заключается в большом числе циклов синтеза (амплификации) специфического фрагмента ДНК, накоплении большого числа копий, которые затем могут быть выявлены обычными методами детекции [9].
ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах.
Преимущества метода ПЦР:
для анализа методом ПЦР пригоден абсолютно любой биологический материал;
специфичность ПЦР равна 100% (при правильном выполнении ПЦР ложноположительный результат невозможен);
высокая чувствительность (ПЦР позволяет выявить от нескольких копий до одного возбудителя в образце);
одновременно можно выявить несколько возбудителей в одном образце;
динамика численности возбудителя заболевания (ПЦР позволяет определять количество копий возбудителя в образце, что позволяет оценить эффективность проводимой терапии);
процесс полностью автоматизирован и результат ПЦР можно получить через несколько часов после начала исследования [8].
Недостатки метода ПЦР:
Несмотря на вышеуказанные достоинства метод ПЦР все же не лишен некоторых недостатков, которые следует учитывать при оценке результатов исследований:
.Амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма. Это налагает определенные требования при использовании ПЦР для контроля эффективности лечения. В общем случае подобный контроль должен проводиться спустя промежуток времени, втечение которого происходит полная элиминация возбудителя. Однако, метод NASBA выявляет РНК только живых микроорганизмов и позволяет избежать этих ограничений.
.Высокая чувствительность. Ряд микроорганизмов (условно - патогенная флора, УПФ) в норме может существовать у человека в малом количестве. При помощи метода ПЦР определяются даже самые малые количества УПФ, даже при отсутствии патологии. Однако эта проблема решена с появлением метода количественного определения ДНК.
.Различия при использовании разных тест систем. Как говорилось выше, для амплификации можно использовать различные участки генома возбудителя. Однако в случае различных мутации микроорганизмов возможно изменение или утрата генов. Это приводит к разным результатам при использовании тест систем разных производителей.
Контаминация - попадание из внешней среды в
реакционную смесь специфических молекул ДНК, способных служить мишенями в
реакции амплификации и давать ложноположительные результаты [4].
.3 Разновидности ПЦР
Вложенная ПЦР (Nested PCR (англ.)) - применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.
Инвертированная ПЦР (Inverse PCR (англ.)) - используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов (лигирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.
ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR (англ.)) - используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы и получают одноцепочечную кДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены.
Асимметричная ПЦР (англ. Asymmetric PCR) - проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.[9].
Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR (англ.)- используется для непосредственного наблюдения за измерением количества конкретного ПЦР продукта в каждом цикле реакции. В этом методе используют флуоресцентно-меченые праймеры или ДНК-зонды для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления.
Ступенчатая ПЦР (Touchdown PCR (англ.)) - с помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров. Первые циклы проводят при температуре выше оптимальной температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру отжига постепенно снижают до оптимальной. С.
Метод молекулярных колоний (ПЦР в геле, англ. Colony - PCR Colony) - акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний[3,7].
ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) - модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч и более оснований). Используют смесь двух полимераз.(англ. Random Amplification of Polymorphic DNA), ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК - используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы.
Групп-специфическая ПЦР (англ. group-specific PCR) - ПЦР для родственных последовательностях внутри одного или между разными видами, используя консервативные праймеры к этим последовательностям. Противоположный этому методу является - уникальная ПЦР (англ. unique PCR), в котором задача состоит в подборе праймеров для амплификации только конкретной последовательности среди родственных последовательностей.
ПЦР с использованием горячего старта (англ. Hot-start PCR) - модификация ПЦР с использованием ДНК-полимеразы, в которой полимеразная активность блокируется при комнатной температуре антителами или имитирующие антитела небольшими молекулами типа Affibody, то есть в момент постановки реакции до первой денатурации в ПЦР. Обычно первая денатурация проводится при 95 °C в течение 10 минут.
Виртуальная ПЦР (англ. in silico PCR, цифровая ПЦР, электронная ПЦР, е-ПЦР) - математический метод компьютерного анализа теоретической полимеразной цепной реакции c использованием списка последовательностей праймеров (или ДНК-зондов) для предсказания потенциальной амплификации ДНК исследуемого генома, хромосомы, кольцевой ДНК или любого другого участка ДНК.
ПЦР в реальном времени (или количественная ПЦР,
англ. Real-time PCR, qPCR, qRT-PCR) -Метод включает в себя одновременно
детекцию и количественное определение (измерение непосредственно количества
копий, либо измерение копий относительно внесенной ДНК или дополнительных
калибровочных генов) специфической последовательности ДНК в образце. Метод
использует общие принципы ПЦР. Основное отличие состоит в том, что измеряется
количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла
амплификации [11].
1.4 Mеханизмы ПЦР. Стадии постановки ПЦР