Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии
146
позволяет установить минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) или минимальную подавляющую концентрацию (МПК) препарата для конкретного возбудителя. В качестве питательной среды используют МПБ или другую среду, соответствующую питательным потребностям возбудителя.
Серийные разведения антибиотиков в жидких средах можно проводить микрометодом в лунках планшетов (рисунок 151), используя в планшете один антибиотик и разные культуры или разные антибиотики и одну культуру. Именно этот принцип используется в тех микробиологических анализаторах, которые предусматривают возможность определения чувствительности исследуемой культуры к антибиотикам.
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
Рисунок 151 – Определение чувствительности бактерий к антибиотикам микрометодом серийных разведений в лунках планшета (концентрация антибиотика убывает сверху вниз; 1-11 – номера культур). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Метод серийных разведений в плотных средах аналогичен предыдущей процедуре, но проводится с использованием плотных питательных сред. Для проведения исследований готовят 8-12 серийных двукратных разведений антибиотиков в пробирках, содержащих охлажденную агаровую среду. Содержимое пробирок перемешивают и переносят в чашки Петри до застывания агара. Затем на поверхность агара проводят посев исследуемой культуры в количестве 1-2 мкл (посевная доза 1-2·104 КОЕ). Посевы инкубируют в течение 18-20 часов при температуре 35-37°С. МПК антибиотиков устанавливают по отсутствию роста культуры на агаре с определенной концентрацией антибиотика.
Диффузионные методы менее чувствительны, чем методы стандартных разведений, но проще в исполнении. На практике их применяют чаще. Эти методы являются качественными и позволяют определять чувствительность бактерий к нескольким антибиотикам одновременно.
Классический диффузионный метод осуществляется следующим образом. В чашки Петри вносят тонкий слой (4-5 мм) агара. После застывания на поверхность агара наносят микробную взвесь и равномерно распределяют по поверхности. После подсушивания чашек в термостате в агаре пробивают лунки диаметром 5 мм и в
147
каждую лунку вносят по 0,1 мл раствора исследуемого антибиотика. Чашки инкубируют в термостате при температуре 36ОС в течение 18-24 часов. После культивирования измеряют диаметр зоны подавления роста вокруг лунки для каждого препарата (рисунок 152).
Рисунок 152 – Результат классического диффузионного метода определения чувствительности бактерий к антибиотикам. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Метод бумажных дисков (диско-диффузионный метод, ДДМ) является наиболее распространенным и технически простым полуколичественным методом определения антибиотикочувствительности бактерий. При выполнении этого метода необходимо выполнять некоторые условия: слой агара должен быть 4,0±0,5 мм (в чашку Петри диаметром 90 мм вносят строго 20 мл агара), а поверхность агара – строго горизонтальной.
Для постановки теста готовят суспензию исследуемых бактерий с концентрацией 1,5·108 КОЕ/мл и 1 мл суспензии наносят на чашку Петри с плотной питательной средой. Суспензию распределяют равномерно по поверхности агара, избыток суспензии удаляют, поверхность среды подсушивают и наносят диски с антибиотиками на расстоянии 2 см друг от друга и от края чашки. На одну чашку Петри наносят не более 6 дисков. Посевы с дисками инкубируют при температуре 35ОС в течение 18-24 часов.
Для постановки диско-диффузионного теста используют коммерческие диски размером 6,25 мм в диаметре из специального фильтровального картона. Диски пропитаны антибиотиком в определенной концентрации (рисунок 153).
Рисунок 153 – Диски с антибиотиками для диско-диффузионного метода. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Вокруг дисков чувствительности роста
взависимости от концентрации
Результат
148
антибиотика и задержки
4
Рисунок 154 – Результаты диско-диффузионного метода определения чувствительности бактерий к антибиотикам. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
С помощью линейки измеряют диаметры зон задержки роста вокруг дисков и по специальным таблицам определяют степень чувствительности микроба к тому или иному антибиотику (рисунок 155).
Рисунок 155 – Измерение диаметра зоны задержки роста культуры. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
За рубежом выпускаются гексадиски (6 объединенных дисков) и октодиски (8 объединенных дисков), позволяющие определять чувствительность бактерий одновременно к 6 или 8 антибиотикам. Для нанесения таких дисков на поверхность агара разработаны специальные диспенсеры (рисунок 156).
149
а б в Рисунок 156 – Диспенсеры (а) для размещения гексадисков (б) и октодисков (в) при
определении чувствительности бактерий к антибиотикам. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Зоны задержки роста культур вокруг дисков измеряют с помощью линейки. Полученные размеры зон сравнивают с величинами зон задержки роста, указанными в инструкции, после чего микроорганизмы относят к той или иной группе (чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным). Показатели активности основных антибиотиков, определяемые методом стандартных индикаторных дисков, представлены в таблице 18.
Таблица 18 – Показатели активности основных антибиотиков, определенные методом стандартных индикаторных дисков
№№ |
Антибиотики |
Код |
Содержание |
Диаметр зоны отсутствия роста, мм |
||
пп |
|
диска |
антибиотика в |
устойчивые |
умеренно |
чувстви- |
|
|
(лат.) |
диске, мкг |
|
устойчивые |
тельные |
1. |
Азтреонам |
АТМ |
30 |
≤15 |
16-21 |
≥22 |
|
|
(Ао) |
|
|
|
|
2. |
Амоксициклин |
АКК |
10 |
≤10 |
11-12 |
≥13 |
|
(амоксиклав) |
(Ас) |
|
|
|
|
3. |
Ампициллин |
АМП |
10 |
≤9 |
10-13 |
≥14 |
|
|
(А) |
|
|
|
|
4 |
Бензилпенициллин |
ПЕН |
6 |
≤11 |
12-21 |
≥22 |
|
|
(Р) |
|
|
|
|
5. |
Ванкомицин |
ВА |
30 |
≤14 |
15-16 |
≥17 |
|
|
(Va) |
|
|
|
|
6. |
Гентамицин |
ГЕН |
10 |
≤13 |
- |
≥14 |
|
|
(G) |
|
|
|
|
7. |
Доксициклин |
ДОК |
10 |
≤12 |
13-19 |
≥20 |
|
|
(Do) |
|
|
|
|
8. |
Канамицин |
КАН |
30 |
≤14 |
15-18 |
≥19 |
|
|
(К) |
|
|
|
|
9 |
Карбенициллин |
КАР |
25 |
≤14 |
15-18 |
≥19 |
|
|
(Cb) |
|
|
|
|
10. |
Клиндамицин |
КЛ |
2 |
≤14 |
15-20 |
≥21 |
|
|
(Cd) |
|
|
|
|
11. |
Левомицетин |
ЛЕВ |
30 |
≤14 |
15-18 |
≥19 |
12. |
Линкомицин |
ЛИН |
15 |
≤19 |
20-23 |
≥24 |
|
|
|
|
|
|
150 |
|
|
(L) |
|
|
|
|
13. |
Линезолид |
(Lz) |
30 |
≤20 |
21-22 |
≥23 |
14. |
Меропенем |
МПН |
25 |
≤13 |
14-15 |
≥16 |
|
|
(Mr) |
|
|
|
|
15 |
Метициллин |
МЕТ |
10 |
≤13 |
14-17 |
≥18 |
|
|
(М) |
|
|
|
|
16. |
Мономицин |
МОН |
30 |
≤13 |
14-17 |
≥18 |
17. |
Неомицин |
НЕО |
30 |
≤13 |
14-17 |
≥18 |
|
|
(N) |
|
|
|
|
18. |
Нетилмицин |
НИЦ |
30 |
≤12 |
13-14 |
≥15 |
|
|
(Nt) |
|
|
|
|
19. |
Нитрофурантоин |
(Nf) |
300 |
≤14 |
15-16 |
≥17 |
20. |
Оксациллин |
ОКС |
10 |
≤19 |
20-23 |
≥24 |
|
|
(Ox) |
|
|
|
|
21. |
Олеандомицин |
ОЛЕ |
15 |
≤12 |
13-17 |
≥18 |
|
|
(Ol) |
|
|
|
|
22. |
Офлоксацин |
(Of) |
5 |
≤12 |
13-16 |
≥17 |
23. |
Полимиксин - В |
ПОЛ |
300 ЕД |
≤8 |
9-12 |
≥13 |
|
|
(Pb) |
|
|
|
|
24. |
Ристомицин |
РИС |
30 |
≤9 |
10-11 |
≥12 |
25. |
Рифампицин |
РИФ |
5 |
≤9 |
10-12 |
≥13 |
|
|
(R) |
|
|
|
|
26. |
Стрептомицин |
СТР |
30 |
≤13 |
14-16 |
≥17 |
|
|
(S) |
|
|
|
|
27. |
Тетрациклин |
ТЕТ |
30 |
≤15 |
16-19 |
≥20 |
|
|
(Т) |
|
|
|
|
28. |
Триметоприм |
ТМ |
25 |
≤10 |
11-15 |
≥16 |
|
|
(Nr) |
|
|
|
|
29. |
Триметоприм / |
ТС |
1,25 / 23,75 |
≤10 |
11-15 |
≥16 |
|
сульфаметоксазол |
|
|
|
|
|
30. |
Фузидин |
ФУЗ |
10 |
≤12 |
13-19 |
≥20 |
|
|
(Fc) |
|
|
|
|
31. |
Фуродонин |
ФД |
300 |
≤14 |
15-16 |
≥17 |
|
|
(Fr) |
|
|
|
|
32. |
Цефазолин |
ЦЗ |
30 |
≤14 |
15-17 |
≥18 |
|
|
(Cz) |
|
|
|
|
33. |
Цефалексин |
ЦФЛ |
30 |
≤11 |
12-16 |
≥17 |
34. |
Цефоперазон |
ЦПН |
75 |
≤15 |
16-20 |
≥21 |
|
|
(Cs) |
|
|
|
|
35. |
Цефоперазон / |
ЦПС |
75 / 30 |
≤15 |
16-20 |
≥21 |
|
сульбактам |
(Cfs) |
|
|
|
|
36. |
Цефтазидим / |
(Cac) |
30 / 10 |
≤14 |
15-17 |
≥18 |
|
клавулановая кислота |
|
|
|
|
|
37. |
Эритромицин |
ЭРИ |
15 |
≤14 |
15-18 |
≥19 |
|
|
(Е) |
|
|
|
|
В случае, когда используются антибиотики, не указанные в представленной таблице, используют универсальную оценочную шкалу (таблица 19).
Таблица 19 – Ориентировочная (универсальная) шкала оценки чувствительности микроорганизмов к антибиотикам при использовании диско-
диффузионного метода