Концентрирование ультразвуковой энергии на наночастицах: медицинский аспект
А.Л. Николаев1
А.В. Гопин1
В.Е. Божевольнов1
Н.В. Дежкунов2
1Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова
2Белорусский государственный университет информатики и радиоэлектроники
Развиваемое авторами направление относится к области ультразвуковой наномедицины. Условно к этой области можно отнести те работы, в которых исследуется взаимодействие ультразвука и малых частиц (мицеллы, липосомы, наноэмульсии, пузырьки, нанокапсулы) вне зависимости от их природы. Размер этих частиц находится в интервале от 10-9-10-6 м. Основной областью практического приложения ультразвуковой наномедицины является терапия онкологических заболеваний.
Метод ультразвуковой нанотерапии злокачественных опухолей, развиваемый нами, отличается от описанных в литературе двумя положениями:
– наночастицы и их агрегаты образуются непосредственно в опухоли из нетоксичного и нелекарственного вещества, введенного в кровоток в виде раствора;
– воздействие ультразвука на опухоль, содержащую агрегаты наночастиц, приводит к эффектам, приводящим к торможению ее роста, а в некоторых случаях к полной ее ремиссии.
Образования наночастиц и их агрегатов непосредственно в опухоли обеспечивается биохимическими особенностями ее роста, совокупность признаков которого носит название атипизма.
В результате метаболического атипизма физико-химические условия в опухоли (пониженное значение pH, повышенное содержание ионов кальция в межклеточной жидкости, монотонность липидной структуры мембран) отличаются от условий в нормальных окружающих опухоль тканей. Эти отличия обуславливают возможность образования твердой фазы преимущественно в опухоли. Твердая фаза выделяется в опухоли после внутривенного введения растворов соединений, кальциевые соли или кислые формы которых в условиях опухоли нерастворимы. Таким образом, можно добиться избирательности образования наночастиц и их агрегатов преимущественно в опухоли, используя наименее специфичные, а, следовательно, наиболее устойчивые проявления ее атипизма.
Эффект при действии ультразвука на биополимерные системы, модифицированные агрегатами наночастиц, достигается за счет дополнительного выделения акустической энергии в участках, в которых эти агрегаты локализованы. Это происходит благодаря тому, что агрегаты, отличаясь физико-химическими свойствами от биополимерных структур, существенно меняют отклик системы на ультразвуковое воздействие [1]. Они локально изменяют коэффициент поглощения ультразвука, являясь своеобразными преобразователями акустической энергии. При этом включения обеспечивают локализацию акустической энергии в объеме, размер которого определяется главным образом размерами агрегатов и может быть существенно меньше масштаба длины волны ультразвука. Если местами локализации агрегатов являются опухолевые клетки, то дополнительное выделение в этих местах акустической энергии способно обеспечить гибель опухоли или замедлить ее рост.
Для успешного применения разрабатываемого метода, необходима постановка модельных экспериментов, направленных на выявление закономерностей, связывающих природу и размер твердофазных соносенсибилизаторов (ТФС), их массовую долю, условия образования в полимерной матрице, природу полимерной матрицы, а также режимы ультразвукового воздействия. Проблемы, которых мы, так или иначе, касаемся в данной работе, можно разделить на три группы:
– выявление влияния полимерной матрицы и условий синтеза на локализацию и морфологию твердофазных модификаторов;
– оценка тепловых и возможных кавитационных эффектов акустического поля в модифицированных гелевых системах;
– определение оптимальных режимов ультразвукового воздействия.
Работы проводились на модельных гелевых системах, имитирующих опухолевую ткань. В качестве гелей использовали гели полиакриламида и агарозы. Их синтезировали по методикам, описанным в работах [2, 3], используя дегазированную воду. Они удобны для предварительных оценок распределения температуры в опухоли в акустических полях различных частот и интенсивностей в присутствии и в отсутствии твердофазных включений, а также для оценки вклада кавитационных процессов в деструкцию полимерной матрицы и разработки методологии синтеза ТФС.
Твердофазными соносенсибилизаторами служили гидроксид железа, кальциевая соль терафтала (октанатриевая соль окта-4,5-карбоксифталоцианина кобальта), сульфат бария, силикагель и гидрофобизованый силикагель.
Синтез образцов, содержащих ТФС, проводили методом встречной диффузии реагентов, образующих при взаимодействии малорастворимое соединение в предварительно синтезированном геле. Метод встречной диффузии реагентов моделирует образование ТФС в условиях метаболического атипизма опухолевой ткани и удобен для исследования процессов, определяемых их взаимодействием с полимерной матрицей (синтез, тепловые и кавитационные эффекты).
Нами разработана математическая модель, описывающая динамику накопления массы модификатора в пористой матрице в условиях относительно близких к фазообразованию in vivo, т.е. в ситуации постоянства концентрации одного компонента в опухоли (A) и убывающей во времени по экспоненциальному закону концентрации другого компонента, введенного в кровоток (B). Схема, описывающее образование твердого модификатора выглядит следующим образом:
где индекс S относится к твердой фазе, k1, k2 - константы скорости прямой и обратной гомогенной реакции, ?0, ?1 - константы нуклеации и роста твердой фазы.
Расчеты, при наличии соответствующей базы данных, дают возможность определить интервал времени, в котором ультразвуковое воздействие на опухоль в данных условиях будет наиболее эффективным.
Анализ экспериментальных данных, относящихся к образцам, полученным встречной диффузией реагентов, показал, что конечную структуру гелей практически во всех случаях определяет взаимодействие полимерной матрицы и ТФС.
На рис. 1 представлены электронно-микроскопические снимки полиакриламидного геля, содержащего кальциевую соль терафтала и гидроксид железа, синтезированные методом встречной диффузии. В случае 1,а) агрегированная фаза соли терафтала локализована на нитях матрицы носителя, элементы которых, по-видимому, являются центрами зарождения твердой фазы модификатора. На фотографии 1,б) структурно различимые фазы включений не видны, что может свидетельствовать о высокой дисперсности и равномерном распределении кристаллов гидроксида железа по нитям матрицы. Это подтверждает исследование образцов гелей полиакриламида, модифицированных гидроксидом железа, методом мессбауэровской спектроскопии, которое показало, что химическая природа матрицы и условия синтеза также вносят существенный вклад в формирование рельефов поверхности и распределение по размерам ТФС. Картина аналогичная распределению терафтала наблюдается и для случая, когда модификатором являлся сульфат бария. Полученные данные свидетельствуют о наличии, по крайней мере, двух типов локализации, кристаллизующейся в гидрогелях твердой фазы. Вероятность реализации каждого из них определяется природой ТФС и полимерной матрицы. Наличие двух типов локализации позволяет предположить, что акустические эффекты в таких системах могут существенно различаться.
ультразвуковой нанотерапия опухоль злокачественный
а) б)
Рис. 1. Электронные микрофотографии полиакриламидного геля, модифицированного методом встречной диффузии: а) кальциевой солью терафтала; б) гидроксидом железа
На рис. 2 приведены типичные кривые динамики роста температуры образцов с различным характером распределения ТФС в гелевых матрицах агарозы, содержащих гидроксид железа и сульфат бария.
В среднем величины поглощенной мощности для образцов с сульфатом бария в 1.5-2 раза выше, чем для образцов с гидроксидом железа (III). При этом следует отметить, что для последних наблюдается даже некоторое уменьшение поглощения ультразвука. Это может быть связано с изменением механических характеристик сетки матрицы, которая в случае этих образцов инкрустируется высокодисперсной твердой фазой гидроксида железа и меняет свои вязкоупругие характеристики.
Полученные данные указывают на важную роль в проявлении акустических тепловых эффектов характера взаимодействия ТФС и матрицы геля, который определяется их химической природой. При этом наибольшим эффектом обладают системы с ТФС, локализованными на отдельных элементах объема матрицы.
Рис. 2. Тепловые эффекты ультразвука в агарозном геле, модифицированном методом встречной диффузии. 1 - гель агарозы (3 масс. %), 2 - гель, модифицированный гидроксидом железа (III) (2 масс. %), 3 - гель, модифицированный сульфатом бария (2 масс. %). Параметры ультразвука: частота 2.64 МГц, интенсивность 2 Вт/см2. Точки - данные измерений с помощью термопары
Другой нашей задачей являлась оценка возможного влияния ТФС на возникновение кавитационных эффектов при воздействии ультразвука с использованными в работе параметрами.
В наших исследованиях мы применяли несфокусированный ультразвук с частотой 0.88 МГц и интенсивностью до 2 Вт/см2. Сравнительную оценку кавитационных свойств гелей, содержащих и не содержащих ТФС, проводили с помощью индикатора кавитации IS-3MS, разработанного в Белорусском государственном университете информатики и радиоэлектроники. Принцип действия прибора основан на регистрации уровня рассеянного шума в полосе частот от 2 МГц до 10 МГц, принимаемого широкополосным гидрофоном. Излучатель диаметром 2 см находился в непосредственном контакте с торцом цилиндрического гелевого образца (диаметр 2.5 см, высота 2 см), т.е. измерения проводились в ближнем поле преобразователя. Гидрофон с диаметром чувствительного элемента 2 мм располагался в непосредственной близости от боковой поверхности образца.
Для экспериментов использовали агарозный гель (1%) без ТФС и гель, содержащий 1% кальциевой соли терафтала.
Результаты эксперимента показаны на графике (рис. 3), на котором по вертикальной оси отложен регистрируемый индикатором IS-3MS уровень шума, а по горизонтальной - интенсивность ультразвука. Как видно из графика, уровень сигнала, зарегистрированного при интенсивности 2 Вт/см2 в модифицированном образце гидрогеля (U1), существенно (более чем в 4 раза) превышает соответствующую величину в геле без модификатора (U2).
Таким образом, график на рис. 3, если и не дает количественной информации о величине кавитационных порогов в модифицированных и немодифицированных гелях, то, по крайней мере, свидетельствует в пользу того, что условия для возникновения и развития кавитации в модифицированных гелях значительно более благоприятны. Если же исходить из часто встречающегося определения кавитации как явления, под которым понимается любая активность газовых пузырьков как созданных ультразвуком, так и существовавших в среде прежде ультразвукового воздействия, то результаты на рис. 3 можно интерпретировать как данные, характеризующие вероятность возникновения кавитационных явлений в гелях с включениями и без них. Добавим, что возможное повышение концентрации газовых пузырьков в модифицированных гелях может к тому же интенсифицировать тепловые эффекты в подобных средах.
В Российском онкологическом научном центре им. Н.Н. Блохина РАМН в течение ряда лет ведутся доклинические исследования, направленные на изучение экспериментальной возможности использования эффекта твердофазной соносенсибилизации для ультразвуковой терапии онкологических заболеваний [4, 5]. Эксперименты проводятся на животных с разными типами опухолей и при различных схемах терапии и включают в себя оценку терапевтической эффективности, безвредности и влияния на метастазирование. В результате этих исследований была установлена высокая терапевтическая эффективность метода, выражающаяся в регрессии опухоли в среднем на 75-80% с увеличением продолжительности жизни животных до 2 раз, хорошая переносимость воздействия и отсутствие влияния на метастазирование.
Рис. 3. Сравнительная оценка уровня широкополосного шума, зарегистрированного в полосе частот 2-10 МГц при воздействии ультразвуковой частоты 0.88 МГц на модифицированные и немодифицированные образцы агарозного геля в зависимости от интенсивности ультразвука. 1 - немодифицированный гель. 2 - кальциевая соль терафтала
В экспериментах, представленных ниже в качестве примера (рис. 4), использовали мышей линии BDF1 с перевитыми опухолями B16. Твердая фаза кальциевых солей карбоксильных производных фталлоцианина кобальта (терафтал) и цинка (ZnPc) формировалась непосредственно в опухолевых клетках [6].
Эксперименты на животных проводили на специально сконструированной установке при одновременном действии двух частот (0.88 МГц, 1 Вт/см2 + 2.64 МГц, 2 Вт/см2). Температуру в опухоли определяли с помощью термопары (точность 0.2°C).
На рис. 4 представлена динамика роста опухоли в нескольких экспериментальных сериях с использованием в качестве ТФС терафтала и ZnPc. Как видно из рис. 4, время удвоения размеров опухоли в экспериментах с использованием ТФС (?ТФС) увеличивается в 10 раз по сравнению с контрольной группой (?К) и в 5 раз по сравнению с действием одного ультразвука (?УЗ). Это означает, что терапевтическая эффективность действия ультразвука в присутствии ТФС существенно повышается. Аналогичные результаты были получены и на других типах опухолей (карцинома Са 755, РС 1, карцинома Эрлиха, карцинома Льюис). По терапевтической эффективности эти результаты были сопоставимы с результатами лечения по оптимальным химиотерапевтическим схемам.
Анализ результатов показывает, что наночастицы нелекарственных веществ являются эффективными твердофазными соносенсибилизаторами, т.е. «усилителями» противоопухолевого действия ультразвука. Этот метод при благоприятном развитии теоретической, экспериментальной и приборной базы должен дополнить существующие методы терапии онкологических заболеваний.