По сравнению с другими методами, БХК метод является одним из наиболее чувствительных (он способен определять белки при концентрациях до 5 мкг / мл), имеет меньшую изменчивость, чем другие (например, Бредфорда), и может быть использован для измерения широкого диапазона концентрации белка.
Анализ белков методами Брэдфорда или с применением Кумасси бриллиантового синего (диапазон: 20-2000 мкг / мл).
Аналитический метод Брэдфорда, первоначально описанный доктором Марионом Брэдфордом в 1976 году, является одним из самых распространенных методов определения концентрации белка. Он основан на образовании комплекса между красителем Кумасси бриллиантовым синим G-250 и белками в растворе. Свободный краситель существует в четырех различных ионных формах. Более анионные формы связываются с белками и имеют оптическую плотность при 590 нм. Концентрация белка может быть оценена путем определения количества красителя в ионной форме и измерением оптической плотности раствора при 595 нм с использованием спектрофотометра. Краситель связывается главным образом с аргинином, триптофаном, тирозином, гистидином, фенилаланином белковых молекул.
Большинство исследователей использует БХК в качестве белкового стандарта, поскольку он является недорогим и легко доступным, но этот стандарт не всегда удобен. Действительно, один недостаток использования БХК в том, что он обладает сильной реакцией красителя, вследствие чего имеется возможность недооценить содержание белка. Иммуноглобулин G (IgG), лизоцим или других стандартные белки должны использоваться в зависимости от типа белкового образца.
Одним из преимуществ этого способа является его совместимость с агентами для стабилизации белков в растворе, которые не совместимы с анализом методом Лоури и в некоторой степени с анализом ДСС. Ограничительным аспектом аналитического метода Бредфорда является несовместимость с низкой концентрацией детергентов, которые обычно используются для растворения мембранных белков. Тем не менее, детергенты могут быть удалены путем гель-фильтрации, диализа или осаждением белков с использованием фосфатом кальция. Еще одним преимуществом является возможность измерять концентрацию белков с высокой молекулярной массой (MМ), поскольку краситель не связывается с пептидами с низкой ММ. Тем не менее, очень низкий уровень неионных детергентов, таких как Triton X-100 в концентрации 0,008% (объем / объем), может улучшить чувствительность и вариабельность анализа Брэдфорда.
Анализа белка методом Лоури (диапазон: 10-1000 мкг / мл).
Анализ методом Лоури, предложенный Оливером X. Лоури в 1951 году, основан на двух химических реакциях. Первой реакцией является снижение ионов меди в щелочной среде, которые образуют комплексы с пептидными связями (реакция Биурета). Второй реакцией является снижение реагента Folin-Ciocalteu комплексом медно-пептидной связи, которое впоследствии приводит к изменению цвета раствора на синий с поглощением в диапазоне от 650 до 750 нм, обнаруживаемого с помощью спектрофотометра. Количество белка в образце может быть оценено с использованием стандартной кривой выбранного стандартного раствора белка, такого как БХК.
Преимуществом данного метода является его чувствительность, а главное, точность. Однако, этот метод требует больше времени, чем другие анализы, и многие соединения, обычно используемые в буферных растворах для приготовления белкового препарата (например, детергенты, углеводы, глицерин, трицин, ЭДТА, Трис) препятствуют анализу методом Лоури и образуют осадки. Тем не менее, влияние этих веществ может быть уменьшено путем разбавления образца, но только тогда, когда концентрация белка достаточно высока. Кроме того, было показано, что время для выполнения этого анализа можно уменьшить путем повышения температуры или использованием микроволновой печи.
Рис. 1
4. Перечислите и охарактеризуйте специфичность ферментов желудочно-кишечного тракта, способных гидролизовать данный белок. Укажите продукты гидролиза
Переваривание белков в желудке
Желудочный сок - продукт нескольких типов клеток. Обкладочные (париетальные) клетки стенок желудка образуют соляную кислоту, главные клетки секретируют пепсиноген. Добавочные и другие клетки эпителия желудка выделяют муцинсодержащую слизь. Париетальные клетки секретируют в полость желудка также гликопротеин, который называют "внутренним фактором" (фактором Касла). Этот белок связывает "внешний фактор" - витамин В12, предотвращает его разрушение и способствует всасыванию.
1. Образование и роль соляной кислоты.
Основная пищеварительная функция желудка заключается в том, что в нём начинается переваривание белка. Существенную роль в этом процессе играет соляная кислота. Белки, поступающие в желудок, стимулируют выделение гистамина и группы белковых гормонов - гастринов (см. раздел 11), которые, в свою очередь, вызывают секрецию НСI и профермента - пепсиногена. НСI образуется в обкладочных клетках желудочных желёз в ходе реакций.
Источником Н+ является Н2СО3, которая образуется в обкладочных клетках желудка из СО2, диффундирующего из крови, и Н2О под действием фермента карбоангидразы (карбонатдегидра-тазы):
Н2О + СО2 > Н2СО3 > НСО3- + H+
Диссоциация Н2СО3 приводит к образованию бикарбоната, который с участием специальных белков выделяется в плазму в обмен на С1-, и ионов Н+, которые поступают в просвет желудка путём активного транспорта, катализируемого мембранной Н+/К+-АТФ-азой. При этом концентрация протонов в просвете желудка увеличивается в 106 раз. Ионы С1- поступают в просвет желудка через хлоридный канал.
Концентрация НСl в желудочном соке может достигать 0,16 М, за счёт чего значение рН снижается до 1,0-2,0. Приём белковой пищи часто сопровождается выделением щелочной мочи за счёт секреции большого количества бикарбоната в процессе образования НСl.
Под действием НСl происходит денатурация белков пищи, не подвергшихся термической обработке, что увеличивает доступность пептидных связей для протеаз. НСl обладает бактерицидным действием и препятствует попаданию патогенных бактерий в кишечник. Кроме того, соляная кислота активирует пепсиноген и создаёт оптимум рН для действия пепсина.
Механизм активации пепсина.
Рис. 1 Секреция соляной кислоты в желудке. 1 - карбоангидраза; 2 - Н+/К+- АТФ-аза; 3 - белки-переносчики анионов; 4 - хлоридный канал.
Под действием гастринов в главных клетках желудочных желёз стимулируются синтез и секреция пепсиногена - неактивной формы пепсина. Пепсиноген - белок, состоящий из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 40 кД. Под действием НСl он превращается в активный пепсин (молекулярная масса 32,7 кД) с оптимумом рН 1,0-2,5. В процессе активации в результате частичного протеолиза от N-конца молекулы пепсиногена отщепляются 42 аминокислотных остатка, которые содержат почти все положительно заряженные аминокислоты, имеющиеся в пепсиногене. Таким образом, в активном пепсине преобладающими оказываются отрицательно заряженные аминокислоты, которые участвуют в конформационных перестройках молекулы и формировании активного центра. Образовавшиеся под действием НСl активные молекулы пепсина быстро активируют остальные молекулы пепсиногена (аутокатализ). Пепсин в первую очередь гидролизует пептидные связи в белках, образованные ароматическими аминокислотами (фенилаланин, триптофан, тирозин) и несколько медленнее - образованные лейцином и дикарбоновыми аминокислотами. Пепсин - эндопептидаза, поэтому в результате его действия в желудке образуются более короткие пептиды, но не свободные аминокислоты.
Нарушения переваривания белков в желудке.
При различных заболеваниях ЖКТ в желудке нарушается выделение НСl и пепсиногена, при этом переваривание белков заметно снижается. Наиболее часто встречаются патологические изменения кислотности желудочного сока. Нарушение образования пепсина отмечают реже и выявляют при более значительных поражениях желудка.
Определение кислотности желудочного сока используют для диагностики различных заболеваний желудка.
Повышенная кислотность желудочного сока обычно сопровождается изжогой, диареей и может быть симптомом язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, а также гиперацидного гастрита. Пониженная кислотность бывает при некоторых видах гастритов. Полное отсутствие НСl и пепсина (желудочная ахилия) наблюдается при атрофических гастритах и часто сопровождается пернициозной анемией вследствие недостаточности выработки фактора Касла и нарушения всасывания-витамина В12. Анацидность (рН желудочного сока >6,0) свидетельствует о значительной потере слизистой оболочкой желудка обкладочных клеток, секретирующих соляную кислоту, что часто вызывает рак желудка.
Кислотность желудочного сока выражается в титрационных единицах (ТЕ) - количество 0,1 М NaOH в 1 мл, затраченное на титрование 100 мл желудочного сока по определённому индикатору. При определении кислотности желудочного сока различают: общую кислотность, связанную НСl и свободную НСl.
· Общая кислотность желудочного сока - совокупность всех кислотореагирующих веществ желудочного сока, представляет собой секрет желудка, собираемый в течение 1 ч.
Переваривание белков в кишечнике.
Желудочное содержимое (химус) в процессе переваривания поступает в двенадцатиперстную кишку. Низкое значение рН химуса вызывает в кишечнике выделение белкового гормона секретина, поступающего в кровь.
Этот гормон в свою очередь стимулирует выделение из поджелудочной железы в тонкий кишечник панкреатического сока, содержащего НСО3-, что приводит к нейтрализации НСl желудочного сока и ингибированию пепсина. В результате рН резко возрастает от 1,5-2,0 до ?7,0.
Поступление пептидов в тонкий кишечник вызывает секрецию другого белкового гормона - холецистокинина (см. раздел 11), который стимулирует выделение панкреатических ферментов с оптимумом рН 7,5-8,0.
Под действием ферментов поджелудочной железы и клеток кишечника завершается переваривание белков.
1. Активация панкреатических ферментов.
В поджелудочной железе синтезируются проферменты ряда протеаз: трипсиноген, химотрипсиноген, проэластаза, прокарбоксипептидазы А и В. В кишечнике они путём частичного протеолиза превращаются в активные ферменты трипсин, химотрипсин, эластазу и карбок-сипептидазы А и В.
Активация трипсиногена происходит под действием фермента эпителия кишечника энтеропептидазы.
Этот фермент отщепляет с N-конца молекулы трипсиногена гексапептид Вал-(Асп)4-Лиз. Изменение конформации оставшейся части полипептидной цепи приводит к формированию активного центра, и образуется активный трипсин. Последовательность Вал-(Асп)4-Лиз присуща большинству известных трипсиногенов разных организмов - от рыб до человека.
Образовавшийся трипсин активирует химотрипсиноген, из которого получается несколько активных ферментов (рис. 9-3). Химотрипсиноген состоит из одной полипептидной цепи, содержащей 245 аминокислотных остатков и пяти дисульфидных мостиков. Под действием трипсина расщепляется пептидная связь между 15-й и 16-й аминокислотами, в результате чего образуется активный р-химотрипсин. Затем под действием р-химотрипсина отщепляется дипептид сер(14)-арг(15), что приводит к образованию д-химотрипсина. Отщепление дипептида тре(147)-арг(148) завершает образование стабильной формы активного фермента - б-химотрипсина, который состоит из трёх полипептидных цепей, соединённых дисульфидными мостиками.
Остальные проферменты панкреатических протеаз (проэластаза и прокарбоксипептидазы А и В) также активируются трипсином путём частичного протеолиза. В результате образуются активные ферменты - эластаза и карбокси-пептидазы А и В.
2. Специфичность действия протеаз.
Трипсин преимущественно гидролизует пептидные связи, образованные карбоксильными группами аргинина и лизина. Химотрипсины наиболее активны в отношении пептидных связей, образованных карбоксильными группами ароматических аминокислот (Фен, Тир, Три).
Карбоксипептидазы А и В - цинксодержащие ферменты, отщепляют С-концевые остатки аминокислот. Причём карбоксипептидаза А отщепляет преимущественно аминокислоты, содержащие ароматические или гидрофобные радикалы, а карбоксипептидаза В - остатки аргинина и лизина.
Последний этап переваривания - гидролиз небольших пептидов, происходит под действием ферментов аминопептидаз и дипептидаз, которые синтезируются клетками тонкого кишечника в активной форме.
· Аминопептидазы последовательно отщепляют N-концевые аминокислоты пептидной цепи. Наиболее известна лейцинаминопептидаза - Zn2+- или Мn2+-содержащий фермент, несмотря на название, обладающий широкой специфичностью по отношению к N-концевым аминокислотам.
· Дипептидазы расщепляют дипептиды на аминокислоты, но не действуют на трипептиды.