Контрольная работа: Катаболизм белка

Это чрезвычайно реактивная аминокислота содержится во всех клеточных мембранах. Она значима для метаболизма липидов и жирных кислот, роста мышц. Играет жизненно важную роль в производстве иммуноглобулинов и антител, является неотъемлемым компонентом белков мозга и нервных оболочек. Важна для синтеза мышечных тканей, участвует в создании всех четырех оснований ДНК, является донором метильных групп.

Организм использует серин в качестве материала для создания креатина, который, соединяясь с водой, придает объем мускулам. Эта аминокислота входит в состав холина, этаноламина, саркозина и фосфолипидов. Может превращаться в пируват (и наоборот), что позволяет печени и мышцам трансформировать гликоген в глюкозу. А также является «прародителем» кислородно-транспортной молекулы гемоглобина, которая придает крови красный цвет и транспортирует оксиген по всему телу. Помимо этого, имеет решающее значение в обмене веществ, участвует в биосинтезе цистеина, необходим для синтеза креатинфосфата.

В человеческом организме серин тесно связан с другими аминокислотами: помогает создавать цистеин из гомоцистеина, служит исходной молекулой для глицина. Меж тем, производство самого серина напрямую зависит от наличия в организме витаминов В3, В6 и фолиевой кислоты.

Серин и глицин - взаимозаменяемые аминокислоты. Когда тело не получает достаточного количества первого вещества, оно начинает использовать глицин и треонин. Однако для этого процесса также нужны витамины группы В.

Подобно другой неосновной аминокислоте - цистеину, серин является катализатором для ферментативных процессов. Кроме того, помогает усваивать креатин (важен для создания и поддержания формы мышц).

Синтез глюкозы также зависит от наличия этой аминокислоты. А потребление белковых продуктов, богатых эти веществом, помогает стабилизировать уровень сахара в крови, предупреждает колебание показателей глюкозы в плазме. Совместное воздействие серина, аланина и глицина позволяет стабилизировать сахар у диабетиков.

Эта цепочка взаимосвязей показывает, насколько важен баланс всех аминокислот и других элементов в организме.

2. Какова ИЭТ данного белка и что это означает

Изоэлектрическая точка (pI) -- кислотность среды (pH), при которой определённая молекула или поверхность не несёт электрического заряда. Амфотерные молекулы (цвиттер-ионы) содержат как положительные, так и отрицательные заряды, наличием которых определяется pH раствора. Заряд различных функциональных групп таких молекул может меняться в результате связывания или, наоборот, потери протонов H+.

В молекулах белков имеются свободные карбоксильные и аминные группы, поэтому они могут диссоциировать как кислоты и как основания т. е. являются амфотерными электролитами.

Каждый белок имеет изоэлектрическую точку при характерном для него pH среды. Для большинства белков изоэлектрическая точка наступает в слегка кислой (почти нейтральной) среде. Такой сдвиг кислотности объясняется тем, что в большинстве белков кислотные свойства преобладают над щелочными и при pH = 7,0 в них больше свободных карбоксильных групп, чем щелочных. Однако часть белков содержит больше аминных, чем карбоксильных групп, т. е. в белках больше диа-миномонокарбоновых кислот. Поэтому такие белки при pH = 7,0 ведут себя как слабые основания. К ним относятся гистоны и протамины. Изоэлектрическая точка у гистонов и протаминов наступает при слабощелочной реакции.

В щелочном растворе подавляется диссоциация аминных групп, молекулы белков заряжаются отрицательно и ведут себя как анионы.

В кислой среде, в результате подавления диссоциации карбоксильных групп, белки заряженные положительно, т.е. являются катионами.

При определенной кислотности раствора, которая получила название изоэлектрической точки (ИЭТ), в молекуле белка устанавливается равенство положительных и отрицательных зарядов, она становится электронейтральной. Положение изоэлектрической точки зависит от содержания и природы основных и кислых групп в молекуле белка. У большинства растительных белков ИЭТ находится в слабокислой среде.

В изоэлектрической точке белок обладает наименьшей растворимостью и легко выпадает в осадок при воздействиях, снижающих гидратацию его молекул (при добавлении органических растворителей или солей). При этом молекулы белка слипаются, образуя более крупные частицы, и выпадают из раствора в виде осадка.

1. Приготовление растворов белка. Из полученных белковых препаратов берут навески по 0,25 г в мерные колбы, приливают по 5 мл 0,5 н. раствора СН3СООNа и растворяют при нагревании на водяной бане. Затем доводят объем водой до 25 мл.

Приготовленные растворы используют для определения изоэлектрической точки белков. Для сравнения используют также белок куриного яйца, разведенный в 10 раз водой и профильтрованный через два слоя марли.

2. Определение ИЭТ. В 8 пронумерованных пробирок вносят по 1 мл раствора белка, приливают воду и 0,01 н. или 0,1 н. раствора уксусной кислоты в количествах.Затем в каждую пробирку приливают по 2 мл ацетона или спирта, содержимое перемешивают и оставляют на 30-40 мин при комнатной температуре. При значении рН, равном или близком ИЭТ белка, раствор мутнеет и выпадает в осадок. В таблице отмечают интенсивность выпадения осадка или его отсутствие. На основании полученных результатов делают вывод о положении изоэлектрической точки анализируемых белков.

Материалы и оборудование: 0,5 н. раствор уксуснокислого натрия (68,5 г СН3СООNа.3Н2О в 1 л), 0,1 н. раствора СН3СООН (6 мл ледяной уксусной кислоты разбавляют водой до литра), 0,01 н. раствор СН3СООН получают путем разбавления 0,1 н. раствора СН3СООН в 10 раз, этиловый спирт, ацетон, белок куриного яйца, семена зерновых и зернобобовых культур или выделенные из них белки, пробирки, колбы мерные на 25 мл, штативы.

Как известно, на свойства белковых веществ оказывает влияние концентрация водородных ионов или pH среды. При низких значениях pH частицы белков заражены положительно, а при высоких -- отрицательно. При определенном pH заряд частиц проходит через нуль. Это состояние называется изоэлектрической точкой. Для большинства белков изоэлектрическая точка, при которой происходит их коагуляция, наступает при pH 4,7--5,5.

Изоэлектрическая точка. В процессе титрования белка от предельно кислой до предельно основной формы должно существовать значение pH, при котором средний заряд белка равен нулю. Это значение pH носит название изоэлектрической точки. При значении pH, равном изоэлектрической точке, данный белок не перемещается в электрическом поле (см. ниже об электрофорезе). Изоэлектрическую точку можно приближенно определить, зная аминокислотный состав белка. Поскольку средний заряд белка зависит от концентрации соли (эта зависимость обусловлена способностью белков связывать ионы, а также изменением р а при изменении ионной силы), изоэлектрическая точка зависит от присутствия в растворе посторонних веществ, в частности от природы и концентрации буфера. В то же время она не зависит от концентрации белка. Изоэлектрические точки большинства белков близки к 7, что обусловлено приблизительно одинаковым содержанием в молекуле белка кислых и основных остатков. Однако существуют и такие белки, у которых изоэлектрические точки существенно отличны от 7. Так, например, пепсин -- протеолитический фермент, функционирующий в сильно кислой среде желудка,-- имеет изоэлектрическую точку, близкую к 1, а изоэлектрические точки протаминов близки к 12.

Для большинства белков изоэлектрическая точка близка к нейтральной среде, но несколько сдвинута в кислую сторону. Это объясняется тем, что кислотные свойства у них преобладают над щелочными и в нейтральном растворе они реагируют как слабые кислоты. Молекула таких белков содержит больше свободных карбоксильных групп, чем аминных, а при гидролизе дает преобладание дйкарбоновых и других кисло реагирующих аминокислот над теми, у которых преобладают основные свойства. Некоторые белки, наоборот, относительно богаче аминными группами и в своем составе содержат больше остатков диаминокислот. В нейтральном растворе они ведут себя как слабые основания. Такие белки (например, гистоны и протамины) имеют изоэлектрическую точку при слабо щелочной реакции.

3. Предложите метод, с помощью которого можно определить концентрацию белка. Укажите принцип метода

Точный количественный анализ белка имеет важное значение для всех экспериментов, связанных с белками во множестве научно-исследовательских тем в области молекулярной биологии, клеточной биологии, биохимии, биологии развития и неврологии.

За последнее столетие были разработаны различные методы для количественного определения белков в определённом анализе, для определения общего содержания белка и для единичных белков.

Общее методы количественного анализа белка включают традиционные методы, такие как измерение УФ-поглощения при 280 нм, бицинхониновой кислоты (БХК) и Брэдфорд анализ, а также альтернативные методы, такие как Лоури или новые аналитические методы, разработанные коммерческими фирмами. Обычно коммерческие поставщики предоставляют хорошо продуманный, удобный комплект для каждого типа анализа.

Индивидуальные методы количественного белка включают твердофазный иммуноферментный (ELISA) анализ, Вестерн-блоттинг, а совсем недавно, и масс-спектрометрию и другие методы.

В данном обзоре мы обсудим некоторые из распространенных методов, используемых для определения концентрации белка, уделяя внимание их преимуществам и ограничениям. Важно отметить, что ни один из этих белковых анализов не является специфичным исключительно для белков, что означает, что небелковые компоненты могут препятствовать анализу или быть совместимыми с белками.

Количественный анализ белка.

Таблица 1 обобщает общие методы количественного анализа белка. Для исследователей важно оценить совместимость каждого анализа с типами образцов, диапазон метода, объем образца, наличие подходящего спектрофотометра, а также затраты времени и средств для выполнения каждого теста.

Таблица 1. Общие методы анализа белков

Абсорбция (оптическая плотность) ультрафиолета при 280 нм (диапазон: 0,1-100 мкг / мл)

Ароматические аминокислоты тирозин и триптофан придают белкам характерный ультрафиолетовый (УФ) спектр поглощения при 280 нм, который обычно используется для оценки концентрации белка. Фенилаланин и дисульфидные связи также способствуют поглощению при этой длине волны, хотя и незначительно. Этот способ прост и требует очень небольшого объема образца, так как новые спектрофотометры используют систему удержания образца во время измерения. Однако белковый образец должно быть чистым и не содержащим никаких небелковых компонентов с тем же спектром поглощения, таких, как нуклеиновые кислоты. Этот способ является самым быстрым, но подверженным ошибкам.

Анализ на основе бицинхониновой кислоты (БХК) или меди (диапазон: 20-2000 мкг / мл).

Анализ на основе бицинхониновой кислоты (БХК) был изобретен Полом К. Смитом в 1985 году в Pierce Chemical Company, крупном дистрибьюторе этого анализа. И БХК анализ, и Lowry анализ основаны на преобразовании Cu2+ в Cu1+ в щелочной среде. Это преобразование определяется как реакции Биурета. Эта реакция зависит от четырех аминокислотных остатков (цистеин, цистин, тирозин и триптофан), а также от пептидной структуры.

БХК является конкретным хромогенным реагентом для Cu1+, и во второй стадии реакции две молекулы БХК реагируют с одним ионом Cu1+. Уменьшенное количество Cu2+ является функцией концентрации белка, что может быть определено спектрофотометрически по изменению цвета раствора образца в фиолетовый, с абсорбцией 562 нм. Степень абсорбции прямо пропорциональна количеству белка, присутствующего в растворе, и она может быть оценена в сравнении со стандартным белком, таким как бычий сывороточный альбумин.

БХК метод более устойчив к различным ионным и неионным детергентам, таким как NP-40, тритон Х-100, и денатурирующим агентам, таким как мочевина и хлорид гуанидина, которые имеют тенденцию препятствовать другим типам колориметрического анализа белков, таким как метод Лоури. Некоторые молекулы, такие например, как молекулы редуцирующие сахара, могут снижать эффективность БХК анализа. Эти эффекты могут быть устранены или уменьшены с помощью нескольких методик, таких как удаление препятствующих анализу веществ через диализ, гель-фильтрацию, или, если концентрация белка достаточно высока, разбавление образца.

Thermo Fisher Pierce недавно представила новую версию классических наборов для БХК белкового анализа от Pierce, совместимых с такими восстанавливающими агентами, как дитиотреитола (ДТТ), 2-merceptoethanol (BME), TCEP и другими дисульфидными восстановителями.