162 Л.П. Жаркова, В.В. Иванов, И.Р. Князева и др.
Изменение объема митохондрий печени мышей 161
УДК 57.043, 576.32/.36
Биологический институт Томского государственного университета
ИЗМЕНЕНИЕ ОБЪЕМА МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ НАНОСЕКУНДНЫХ ИМПУЛЬСНО-ПЕРИОДИЧЕСКИХ МИКРОВОЛНОВОГО И РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЙ
Л.П. Жаркова
В.В. Иванов
И.Р. Князева
Одной из внутриклеточных мишеней наносекундных импульсно-периодических микроволнового (ИПМИ) и рентгеновского (ИПРИ) излучений могут быть митохондрии. Подтверждением этому являются экспериментальные данные о влиянии ИПМИ и ИПРИ на импеданс суспензии митохондрий [1] и дыхание органелл, изолированных из печени мышей [2]. В работах предполагалось, что воздействие ИПМИ и ИПРИ способно запускать процессы окислительной модификации липидов и белков, что должно изменять физико-химические свойства биологических мембран и влиять на ионные потоки через них. Согласно современным представлениям окислительное повреждение органелл является мощным индуктором неспецифической проницаемости мембран митохондрий [3]. При этом считается, что в регуляции индукции неспецифической проницаемости внутренней мембраны органелл важную роль играет окисление специфических тиоловых групп в белках митохондрий. Она, наряду с оксидантами, индуцируется так же снижением уровня адениновых нуклеотидов и высокими концентрациями ионов кальция в митохондриях [4].
Изменение ионных потоков в митохондриях под воздействием ИПМИ и ИПРИ должно приводить к изменению их объёма, поскольку накопление или обеднение матрикса органелл теми или иными ионами сопровождаются переносом молекул воды в него или из него соответственно. Изменение объёма митохондрий приводит к изменению светопропускания суспензии органелл, что можно регистрировать с помощью спектрофотометра [5-8]. Регистрация изменения объема митохондрий в среде, содержащей ионы Ca2+, позволяет оценить изменение чувствительности неспецифической проницаемости митохондрий в ответ на действие различных факторов [6].
Такой метод с успехом был использован для решения многих задач, связанных с оценкой функционального состояния митохондрий, в частности при изучении их дыхания, при исследовании механизмов переноса веществ через внутреннюю мембрану, а также при оценке влияния различных веществ [6] или при определении функционального состояния организма в условиях развития окислительного стресса [9]. Поэтому цель настоящего исследования - изучить влияние ИПМИ и ИПРИ на митохондрии по изменению их объема с помощью регистрации оптической плотности суспензии органелл.
Материалы и методики исследования
Эксперименты выполнены на митохондриях, изолированных из печени мышей. Все процедуры, связанные с забором печени из организма животных, осуществлялись в соответствии с нормами гуманного обращения с животными [10]. Опыты проводились в одно и то же время суток (в утренние часы). Изолированные митохондрии из печени мышей были получены общепринятым методом дифференциального центрифугирования [11]. Все манипуляции проводились при температуре от +1 до +4°С. Печень освобождалась от крови путем перфузии in situ, охлажденной до 0°С средой выделения, содержащей 0,3 М раствор сахарозы, 1 мМ раствор ЭДТА, 10 мМ Трис-буфер (pH 7,4). Навеска печени 1,5 г измельчалась в гомогенизаторе Поттера. Для удаления не полностью разрушенных клеток и ядер гомогенат центрифугировался в течение 5 мин на рефрижераторной центрифуге ЦРЛ-1 (Россия) при 5000 g (0....+2°С). После этого надосадочная жидкость в течение 5 мин центрифугировалась при 10000 g (0....+2°С). Осадок митохондрий тщательно ресуспендировался в среде, содержащей 0,3 М сахарозы и 20 мМ трис-буфер (рН 7,4). Полученная суспензия митохондрий хранилась на тающем льду. Количество белка определялось по Бредфорду [12].
Для облучения суспензии митохондрий ИПМИ использовался лабораторный импульсный генератор на основе магнетрона МИ-505 (несущая частота 10 ГГц, длительность импульсов на половинном уровне мощности 100 нс, частота повторения 10-22 имп./с, пиковая плотность потока мощности (пППМ) варьировала от 70 до 1500 Вт/см2). Измерение пППМ проводилось в соответствии с работами [13, 14]. В качестве источника ИПРИ применялся ускоритель Sinus 150, разработанный в Институте сильноточной электроники СО РАН (г. Томск) [15], который генерировал фотоны рентгеновского излучения с энергией 90-120 кЭв, длительностью импульса 4 нс, частотой повторения 10-22 имп./с, дозой в импульсе 0,3-2 мР/имп. и суммарной поглощенной дозой до 80 мГр.
В работе тестировались суспензии митохондрий, облученные 4 000 импульсов ИПМИ или ИПРИ и ложнооблученные суспензии, которые подвергались аналогичным манипуляциям, что и облученные, но без включения источников излучения. Длительность воздействия варьировала от 3 до 7 мин в зависимости от частоты повторения импульсов.
Изменение объема митохондрий в суспензии после облучения ИПМИ или ИПРИ регистрировалось с помощью спектрофотометра СФ 103 (Россия) по изменению оптической плотности при длине волны 540 нм. Облученные или ложнооблученные суспензии митохондрий (1 мг митохондриального белка) помещались в среду, состоящую из 250 мМ сахарозы, 5 мМ KH2PO4, 2,5 мМ MgCl2 (рН 7,4, 25°С). Митохондрии энергезировались добавлением 5 мМ сукцината. Для измерения скорости набухания митохондрий в присутствии ионов Ca2+ в инкубационную среду сразу после воздействия ИПМИ или ИПРИ добавлялся раствор CaCl2 в конечной концентрации 200 нмоль/ мг белка.
Все эксперименты были проведены в 6 повторностях для каждого из использованных режимов воздействия. Величина эффекта рассчитывалась по изменению оптической плотности облученных образцов относительно этого показателя у ложнооблученных (рис. 1).
Полученные результаты подвергались статистической обработке, при которой рассчитывались средняя арифметическая величина показателя и её стандартная ошибка. Значимость различий между показателями облученных и ложнооблученных выборок определялась с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни [16]. Все расчёты были выполнены с использованием лицензионного пакета компьютерных программ StatSoft Statistica 6.0. импульсный митохондрия печень органелла
Результаты исследования и обсуждение
На рис. 1 представлены типичные кривые регистрации набухания митохондрий по изменению оптической плотности суспензии органелл после воздействия ИПМИ или ИПРИ. Для унификации оценивания эффекта воздействия показатели изменения объёма митохондрий регистрировались через 5 мин после прекращения облучения и, соответственно, через 5 мин после добавления ионов Ca2+, которое осуществлялось сразу же после прекращения облучения.
Эффект воздействия ИПМИ. После облучения митохондрий ИПМИ с пППМ 70, 700 и 1500 Вт/см2 при всех использованных частотах повторения импульсов изменений оптической плотности митохондрий в среде без ионов Са2+ не наблюдалось (рис. 2, А), что указывало на отсутствие существенного изменения объема митохондрий.
Это означает, что изменения ионных потоков не происходило либо потоки изменялись, но суммарный баланс переноса зарядов сохранялся. Результаты экспериментов согласуются с полученными нами ранее данными о том, что воздействие ИПМИ с пППМ 700 и 1500 Вт/см2 при аналогичных частотах не изменяло импеданса суспензии митохондрий [17]. Однако воздействие с пППМ 70 Вт/см2 снижало этот параметр [17].
Можно предположить, что при низкоинтенсивном воздействии (пППМ 70 Вт/см2) мембрана митохондрий становится более проницаема для ионов, о чем свидетельствует снижение импеданса суспензии. Однако при этом перенос ионов сбалансирован и ионная сила матрикса митохондрий не изменяется, а следовательно, потоки воды через внутреннюю мембрану отсутствуют и потому объем остается неизменным.
При измерении индуцированного ионами Ca2+ набухания митохондрий, облученных ИПМИ, наблюдался иной эффект. После воздействия ИПМИ с пППМ 70 Вт/см2 при всех использованных частотах оптическая плотность суспензии митохондрий повышалась относительно ложнооблученных образцов (рис. 2, Б). Это означало, что такое воздействие приводит к снижению чувствительности неспецифической проницаемости митохондрий, индуцированной ионами Ca2+.
Рис. 1. Типичные кривые регистрации изменения оптической плотности суспензии изолированных митохондрий печени мышей после воздействия: А - в среде без ионов Ca2+; Б - с добавлением ионов Са2+ (200 нмоль/мг белка) (описание в тексте)
Более интенсивное воздействие ИПМИ (700 Вт/см2) с частотами повторения 10 и 16 имп./с, наоборот, сопровождалось уменьшением оптической плотности облученной суспензии. Это может быть результатом того, что после воздействия с таким режимом повышается чувствительность неспецифической проницаемости митохондрий к ионам Ca2+ и происходит более раннее открытие пор неспецифической проницаемости, в органеллы поступает вода и митохондрии быстрее набухают. Воздействие ИПМИ с интенсивностью 1500 Вт/см2 при всех использованных частотах повторения импульсов значимо не меняло оптическую плотность суспензии митохондрий в ответ на ионы Ca2+ в сравнении с ложнооблученными образцами. Это означает, что потоки ионов через внутреннюю мембрану не меняются либо изменяются с полной компенсацией переносимых зарядов, поэтому и объем не изменяется.
Рис. 2. Изменение оптической плотности суспензии митохондрий на 5-й минуте после воздействия ИПМИ с пППМ 70, 700 и 1500 Вт/см2 и частотами повторения импульсов 10, 13, 16 и 22 имп./с в среде инкубации: А - в среде без ионов Ca2+;
Б - с добавлением ионов Са2+ (200 нмоль/мг белка). Заштрихованное пространство -
95%-ный доверительный интервал среднего значения показателя в ложнооблученных образцах. * - различия между показателями облученной и ЛО выборок статистически значимы (р ? 0,05)
Эффект воздействия ИПРИ. Воздействие ИПРИ на митохондрии в среде без ионов кальция и при индукции набухания ионами Са2+ сопровождалось реагированием разного характера (рис. 3).
Рис. 3. Изменение оптической плотности суспензии митохондрий на 5-й минуте после воздействия ИПРИ с дозами 0,3-2 мР/имп. и частотами повторения импульсов
10-22 имп./с в среде инкубации: А - в среде без ионов Ca2+; Б - с добавлением ионов Са2+ (200 нмоль/мг белка). Обозначения аналогичны использованным на рис. 2
После облучения митохондрий в среде без ионов кальция ИПРИ с дозой 0,3 мР/имп. наблюдалось увеличение оптической плотности суспензий (рис. 3, А) и этот эффект зависел как от частоты повторения импульсов, так и от дозы. При этом воздействие с частотами повторения 10, 13 и 16 имп./с повышало оптическую плотность суспензии и эффект был обратно пропорционален частоте. Облучение суспензии с максимальной из использованных доз (2 мР/имп.) сопровождалось изменением оптической плотности, причем эффект был также обратно пропорционален частоте повторения импульсов (воздействие с частотой 10 имп./с сопровождалось значимым повышением оптической плотности, а воздействие с частотой 22 имп./с - значимым понижением оптической плотности) (рис. 3, А). ИПРИ с дозой 1,1 мР/имп. при всех частотах повторения импульсов не влияло на оптическую плотность облученной суспензии (рис. 3, А).
При измерении индуцированного кальцием изменения объема митохондрий после их облучения ИПРИ наблюдался иной эффект. Воздействие со всеми дозами и с частотами повторения 13 и 22 ипм./с увеличивало оптическую плотность суспензии митохондрий (рис. 3, Б). При этом величина эффекта возрастала пропорционально увеличению частоты повторения импульсов. Наибольшее снижение оптической плотности наблюдалось после воздействия с частотой повторения 22 имп./с и дозой 0,3 мР/имп. Полученные результаты могут свидетельствовать о повышении чувствительности неспецифической проницаемости мембран митохондрий, индуцированной ионами кальция, обусловленном более ранним открытием пор неспецифической проницаемости в ответ на добавление Са2+.
Заключение
Полученные результаты свидетельствуют о влиянии наносекундных ИПМИ и ИПРИ на функциональное состояние митохондрий, оцененное по их объему. Эффект зависел от частоты повторения импульсов, от интенсивности или дозы воздействия, природы воздействующего фактора (ИПМИ или ИПРИ), а также от отсутствия или наличия ионов кальция в среде инкубации митохондрий. После воздействия можно было наблюдать как сокращение объема митохондрий (в большинстве случаев), так и их набухание. Причинами сокращения объема митохондрий могли быть: а) образование дополнительных структур проводимости, например разрывы во внутренней мембране митохондрий, которые обеспечивали нескомпенсированный выход ионов из матрикса, что инициировало вывод воды из митохондрий; б) изменение эффективности работы мембранных структур в сторону усиления вывода ионов.
Набухание митохондрий после воздействия может быть связано с окислительным стрессом, последующей активацией ПОЛ, в результате чего происходят частичное нарушение фосфолипидов мембран митохондрий и увеличение проницаемости внутренней мембраны митохондрий как для протонов, так и для других ионов [9]. Другим механизмом, также приводящим к повреждению митохондрий, может быть индукция поры неспецифической проницаемости на внутренней мембране. АФК в определенных условиях могут потенцировать открытие поры, поэтому эти два механизма обычно взаимосвязаны [3]. Ранее было показано, что воздействие ИПМИ или ИПРИ на митохондрии приводит к изменению уровня пероксида водорода в этих органеллах [18]. Результаты настоящей работы указывают на реальную возможность изменения чувствительности поры неспецифической проницаемости после воздействия ИПМИ или ИПРИ (рис. 2, Б и 3, Б). В результате ИПМИ или ИПРИ могут приводить к более раннему или замедленному открытию пор в ответ на ионы кальция. Это сопровождается более ранним или более поздним набуханием органелл в ответ на Са2+. Такой эффект может быть обусловлен окислением специфических тиоловых остатков белка митохондрий активными формами кислорода, являющимися важным регулятором индукции пор неспецифической проницаемости органелл [3]. При этом через такие неспецифические поры по градиенту электрического поля вначале могут входить преимущественно только катионы (в первую очередь ионы K+, Ca2+), которые начинают накапливаться в матриксе с одновременным накоплением аниона фосфата. Увеличение осмотического давления в результате этого приводит ко входу воды внутрь митохондрий и их набуханию. Отсутствие изменения объема митохондрий после воздействия может быть обусловлено либо отсутствием влияния, либо, что более важно, увеличением встречных потоков ионов, компенсирующих изменения осмомолярности. В этом случае преимущественного потока воды не должно быть, а значит, не будет изменяться объем митохондрий.