Курсовая работа (т): Характеристика иммунологических свойств c-di-GMP

Характеристика иммунологических свойств c-di-GMP

Введение

иммунный трансдукция бактерия рецепция

Прошло около 30 лет с момента открытия циклического димера (3 '→ 5') гуанозинмонофосфата (циклический ди-ГМФ или c-di-GMP). В силу неясности аллостерического активатора бактериальной синтазы целлюлозы, с-di-GMP стал одним из наиболее распространенных и важных вторичных посредников бактериального генеза. Циклический ди-ГМФ регулирует образование биопленки, вирулентность, клеточный цикл, дифференциацию и другие процессы. Большинство ц-ди-ГМФ-зависимых сигнальных путей контролируют способность бактерий взаимодействовать с абиотическими поверхностями (горная порода, камни) или с другими бактериальными и эукариотическими клетками (стенки кишечника, зубы).

Циклический di-GMP играет ключевую роль в изменении образа жизни многих бактерий, в том числе переход от подвижного к неподвижному (статичному) состоянию, которое помогает в создании колоний, а также переход от ядовитого состояния при острых инфекциях до менее ядовитого. С практической точки зрения биологическое моделирование ц-ди-GMP-сигнальных путей у бактерий может представлять собой новое направление в изучении образования и рассредоточения биопленок в медицинских и промышленных (преимущественно, пищевых) целях, так как циклический ди-ГМФ участвует в передаче сигналов подобно электрическим импульсам в нервной системе у животных.

Но самым важным является тот факт, что ц-ди-ГМФ может быть использован в качестве иммуномодулятора, иммунного усилителя вакцины (адъюванта вакцины) и применятся как химиотерапевтическое, иммунопрофилактическое лекарственное средство.

Цель работы: изучить литературу по исследованиям c-di-GMP, углубить и расширить теоретические знания о действии c-di-GMP.

Задачи: изучить строение циклического димера гуанозинмонофосфата; изучить клетки-мишени иммунной системы человека и рецепцию c-di-GMP, изучить путь активации c-di-GMP и проанализировать сферу применения циклического дигуанилатамонофосфата; предложить новые направления в исследовании c-di-GMP; дать заключение по проделанной теоритической работе.

1. Структурная характеристика c-di-GMP

1.1 Структура и краткий исторический очерк

Циклический ди-ГМФ (Рисунок 1.1) - это небольшая молекула с молярной массой 690.09 г./моль, химическая формула которой - C₂₀H₂₄N₁₀O₁₄P₂, которая впервые была описана в 1987 году в качестве аллостерического активатора бактериальной синтазы целлюлозы (Ross P. И др., 1987) в Acetobacter xylinum, которая переименована в Gluconacetobacter xylinus. У эукариот эта молекула не обнаружена. В структуре, то есть в цикле, содержатся два гуанина, соединенные посредством двух молекул рибозы и двух фосфатов.

Рисунок 1.1. Структурная формула циклического димера (3 '→ 5') гуанозинмонофосфата

В течение последних 29 лет ц-ди-ГМФ вовлекался во все большее число клеточных функций, в том числе регуляцию клеточного цикла (D'Argenio DA и др., Jenal U, 2004; Römling U и др., 2005; Jenal U и др., 2006; Tamayo R и др., 2007). С помощью ферментов синтеза и деградации ц-ди-ГМФ был определен во всех основных бактериальных филумах (таксономических разрядах) и в настоящее время признан в качестве универсального бактериального вторичного посредника.

1.2 Функции ц-ди-ГМФ в бактериях

В последнее десятилетие были проведены многочисленные исследования, касающиеся ц-ди-ГМФ, его биосинтеза и сигнализации. Два важных белка были идентифицированы, которые регулируют уровень этого вторичного посредника у бактерий: дигуанилатцикланаза (ДГЦ) и фосфодиэстераза (ФДЭ). Первый синтезирует ц-ди-ГМФ из двух молекул гуанозинтрифосфатов (ГТФ), тогда как последний расщепляет фосфодиэфирную связь для синтеза промежуточного соединения, которое затем превращаются в две молекулы цГМФ (Рисунок 1.2) (Galperin, M. Y и др., 2001). В зависимости от условий окружающей среды и соседствующих колоний сенсорные белки, расположенные на плазматической мембране (Barends, T.R., 2009), посылают сигналы через сложный каскад реакций, что приводит к повышенной экспрессии ц-ди-ГМФ, где, в свою очередь, ДГЦ и ФДЭ контролируют его концентрацию в клетке.

Рисунок 1.2. Синтез циклического гуанилатмонофосфата в бактериальной клетке

В зависимости от окружающей среды концентрация ц-ди-ГМФ влияет на различные клеточные функции, в том числе формирование биопленок, изменения в клеточной поверхности, отвечающие за объединение в колонии и регуляции моторики бактериального жгутика (Yan, H. & Chen, W, 2010). Например, Gluconacetobacter xylinus, в которой ц-ди-ГМФ был впервые идентифицирован, способна ощущать изменение концентрации кислорода в среде с помощью мембранных рецепторов и увеличивать анаболизм целлюлозы через сигнализацию ц-ди-ГМФ, обеспечивая индуцируемый сдвиг активности синтазы целлюлозы в зависимости от анаэробных или аэробных условий (Ross, P. и др., 1987). Другой пример роли ц-ди-ГМФ в метаболизме бактерий можно рассмотреть в кишечных палочках Pseudomonas aeruginosa и Salmonella Typhimurium, в которых увеличение концентрации ц-ди-ГМФ вызывает образование биопленки и экспрессию факторов вирулентности единовременно (Simm, R. И др., 2001). Считается, что сигналы, продуцируемые ц-ди-ГМФом, выступают в качестве «переключателя образа жизни», регулирующие «отношения» между клетками, реакции в них, их адгезию (Pesavento, C. & Hengge, R., 2009).

Спорным вопросом с точки зрения эволюции остается тот факт, что бактерии, вызывающие воспалительные процессы, продуцируют ц-ди-ГМФ, который распознается иммунной системой высших эукариот. Karaolis и др. были первымы, кто показал, что ц-ди-ГМФ способен активировать незрелые дендритные клетки человека, секретировать несколько ключевых цитокинов и хемокинов. Другие исследования подтвердили иммуностимулирующую активность ц-ди-ГМФ и молекула теперь воспринимается как ПАМП (патоген - ассоциированные молекулярные паттерны).

2. Клетки-мишени иммунной системы и рецепция ц-ди-ГМФ

2.1 Общие положения

Все живые организмы, от простых одноклеточных микроорганизмов до сложных многоклеточных систем, развивали специфические и неспецифические типы защитных реакций самостоятельно (то есть вырабатывали иммунитет), направленный против пагубного действия других организмов, которые потенциально могут причинить вред. Например, бактерии обладают элементарной иммунной системой, используя ферменты для защиты от бактериофагов, в то время как антимикробные пептиды обеспечивают защиту от проникновения патогенов у плодовых мушек (Bulet, P., 2004). У высших таксонов позвоночных животных такие защитные механизмы известны как иммунная система.

Для достижения этой задачи, защиты от патогенных микроорганизмов, иммунная система должна выполнять четыре основные задачи. Во-первых, присутствие патогена следует распознать таким образом, чтобы иммунная смогла его инактивировать. Этот процесс известен как иммунологическое распознавание. После успешного распознавания, инфекция должна быть устранена быстро, чтобы минимизировать ущерб. Это достигается за счет иммунных эффекторных функций (Medzhitov R., 2007). Тем не менее, если не остановить вышеупомянутые эффекторные механизмы, по существу, иммунная система обратится против самого хозямна, поэтому эволюцией были предусмотрены иммунные регуляторные механизмы (Sakaguchi, S, 2008). Последняя задача: иммунная система должна как можно быстрее среагировать на рецидивирующую или персистирующую инфекцию через механизм, известный как иммунологическая память (Pulendran, B., 2006).

Иммунная система состоит из различных «отсеков». Физические и химические барьеры хозяина составляют первую линию защиты против инфекционных агентов. Например, плотные соединения клеток в эпидермисе создают физический барьер и ограничивают проникновение патогена (Su, L., 2008). Эти барьеры защищают человека, обеспечивая изолированный наружный слой, чтобы предотвратить случайное попадание инфекционного агента (Schauber, J. & Gallo, R.L., 2008). Когда первая линия обороны нарушается молекулами захватчика или организмов, врожденные иммунные клетки, такие как дендритные клетки (ДК) и макрофаги активируются (Geissmann, F., 2010). Врожденная иммунная система эволюционировала, чтобы распознавать общие структуры молекул, представляющие собой патогены. Она также должна вызвать адаптивную реакцию организма к инфекционным агенты посредством специализированных антигенпрезентирующих клеткок (АПК), в том числе макрофаги и моноциты (Guermonprez, P., 2002). Там, где неспецифический иммунный ответ недостаточен и не в состоянии обезвредить инфекцию, иммунная система, состоящая из Т и В лимфоцитов генерирует весьма специфический ответ на патоген.

Патоген - это молекула, представляющая собой полисахарид, липополисахарид или мембранный белок, которые рассматриваюися иммунной системой как антигены, где антиген определяется как любое вещество, способное вызывать иммунной ответ. В отличие от врожденных реакций, адаптивные реакции отличаются высокой специфичностью к антигену (Flajnik, M.F. & Du Pasquier, L., 2004).

Лимфоидная ткань в организме

Все клетки крови дифференцируют, начиная с гемопоэтических стволовых клеток-предшественников, находящихся в одном из первичных лимфоидных органов - костном мозге (Orkin, S.H., 2000). На ранней стадии развития гемопоэтические стволовые клетки дифференцируют на два основных типа клеток: общие миелоидные клетки-предшественники дают начало клеткам миелоидного происхождения, включая мегакариоцитов, эритроцитов, гранулоцитов и макрофагов; в то время как общие лимфоидные клетки-предшественники развиваются в В-клетки, Т-клетки и естественных киллеров (ЕК) (Iwasaki, H. & Akashi, K., 2007; Klug, C.A., 1998). Тем не менее, дендритные клетки как наиболее важные антиген-представляющие клетки имеют различные типы и может исходить от обоих «прародителей» (Cella, M., 1997).

После созревания, белые кровяные тельца распределяются по всему телу, а некоторые, такие как макрофаги, локализуются преимущественно в органах и тканях, а другие, такие как Т-и В-лимфоциты, циркулируют между кровью и вторичными лимфоидных тканями, в том числе селезенкой и лимфатическими узлами (Schwab, S.R. & Cyster, J.G., 2007). Антигенпрезентирующих клеток, в том числе ДК, моноциты, макрофаги могут мигрировать из тканей во вторичные лимфоидные органы через лимфатические сосуды (Chtanova, T., 2009). Вторичные лимфоидные органы, такие как селезенка, отображают характерную модель сегрегированном Т-и В-клеток и областей, где каждый из популяции лимфоцитов находится в тесном контакте с АПК (Qiu, C.H., 2009).

Врожденный иммунитет и рецепция

Первая «встреча» с инфекционным агентом обычно происходит в тканях, где макрофаги и ДК являются первыми клетками, которые инициируют секреции цитокинов и хемокинов (Walport, M. и др., 2008). Такие секретируемые факторы способствуют воспалительной реакции, характеризующаяся вазодилатацией ближайших вен и увеличением притока моноцитов и нейтрофилов к месту воспаления, что приводит к повышению температуры, покраснению, боли, отеку (Rivas, F., 2010).

ДК и макрофаги оснащены специализированными рецепторами, известные как рецепторы опознавания паттерна (РОП), которые расположены в нескольких клеточных конгломератах, в том числе на поверхности мембран, эндосомах и в цитозоле (Takeuchi, O. & Akira, S., 2010). РОПы способны распознавать молекулы - патогенами - известные под общим названием патоген - ассоциированные молекулярные паттерны (ПАМП). Семейство РОП имеет несколько подсемейств, в том числе Toll-подобные рецепторы подсемейства (TLR - Toll-like receptor), содержащие ретиноевую кислоту, экспрессируемые RIG (Retinoic acid-inducible gene-I). Эти рецепторы имеют места связывания, с которыми могут связываться только определенные ПАМП, например, липополисахариды грамотрицательной бактериальной клеточной стенки таких как грамотрицательные компонентов бактериальной клеточной стенки распознаются плазматической мембраной ДК TLR4, в то время как неметилированные цитозин-фосфат-гуанин мотивы (CpG мотивы), продуцируемые бактериальной клеткой распознаются эндосомами через TLR9. Многие из РОПов являются сигнальными рецепторами, где связывание лиганда активирует каскад реакций, экспрессирующих гены, ответственные за иммунный ответ. Некоторые рецепторы из данного семейства также могут распознавать вирусные нуклеотиды.

Приобретенный иммунитет

Еще одной отличительной способностью иммунной системы адаптивного иммунитета, который выражен клеточно-опосредованным ответом Т- и В-клетками. Каждая В-клетка и Т-клетка экспрессирует антигенпрезентирующие рецепторы, также известные как Т-клеточные рецепторы (ТКР) и рецепторы В-клеток (ВКР) соответственно, которые связываются лишь с одним антигеном из триллионов возможных, находящихся в природе. Репертуар этих антигенраспознающих рецепторов предопределен еще во время созревания этих клеток при помощи процесса соматической рекомбинации Lebien, T.W. & Tedder, T.F., 2009). После связывания с антигеном специфические Т- или В-лимфоциты, которые их распознали, проходят через циклов клеточного деления, дабы «посадить» на свою мембрану большее количество рецепторов. Поступая таким образом, лимфоциты становятся все более и более специфичными. Процесс распознавания антигенов в В-клетках проходит непосредственно (т.е. ВКР связывается с конкретным локусом антигена). После распознавания антигена В-клетки дифференцируются в секретирующие антитела (плазмоциты). В противоположность этому Т-клетки не способны к прямому связыванию с антигенами. ТКР могут связываться только с пептидами, полученными из антигенов, которые предоставлены им в сочетании с главным комплексом гистосовместимости (MHC). Из них класс I MHC экспрессируется на всех ядросодержащих и функцией этого класса является цитозольная презентация антигенов для CD8+ Т-клеток. Экспрессия MHC класса II ограничена АПК, а функция этого класса - представление эндоцитарных антигенов CD4+ Т-клеткам. После распознавания антигена через MHC класса I, CD8+ Т-клетки активируются и уничтожают зараженные клетки-мишени посредством высвобождения специализированных ферментов (перфорин и гранзим В).

Хотя приобретенный иммунитет полностью зависит от Т- и В-лимфоцитов, характер реакции сильно зависит от врожденного иммунитета. Например, некоторые патогена внутри клеток воспринимаются ДК через РОП, что приводит к высвобождению цитокинов. В зависимости от комбинации цитокинов, присутствующих в цитозоле, CD4+ Т-клетки, окруженные этими ДК, могут дифференцироваться в различные типы Т-хелперов, в том числе Th₁, Th₂, Th₁₇ или регуляторные клетки (Treg), которые обеспечивают помощь в борьбе с внутриклеточными патогенами, паразитарными инфекциями, бактериями и подавляют иммунную систему при отторжении органов после пересадки. Например, секрецию IL12 из АПК во время распознавания пептида Т-клетками приводит к образованию Т-хелперного типа Th₁, в то время как присутствие IL-4 индуцирует развитие Тh₂. Эти типы Т-хелперов оказывают помощь В-клетками. В ходе этого процесса В-клетки изменить тип антител, которые секретируют IgM, IgG или IgE (Chen, K. и др., 2009; Czyzewska-Buczyńska, A., Lewandowicz-Uszyńska, A. & Jankowski, A., 2006; Geisberger, R., Lamers, M. & Achatz, G., 2009).

2.2 Рецепция ц-ди-ГМФ

Как объяснялось ранее, врожденная иммунная система имеет свои механизмы, которые способны распознавать уникальные молекулярные антигены микроорганизмов, которые обычно присутствуют в теле хозяине. Ц-ди-ГМФ обладает различными иммуностимулирующими свойствами, которые поднимают вопрос о механизме распознавания соединения.

Для того, чтобы понять механизм внутриклеточной активации ц-ди-ГМФ, необходимо рассмотреть с какими рецепторами он связывается, природу рецепторов и клетки, которые несут на себе вышеупомянутые рецепторы. Циклический нуклеотид действует преимущественно на дендритные клетки, плазмоцитные и миелоидные.

Одной из центральных стратегий в области распознавания инфекции врожденной иммунной системы является обнаружение патогенных микроорганизмов и распознавание их нуклеиновых кислот. Возбудитель несет в себе нуклеиновые кислоты. Несколько рецепторов нуклеиновых кислот были идентифицированы. Это эндосомные TLR3, TLR7 и TLR9, цитозольные RIG-I (Retinoic acid-inducible gene-I), MDA5 (Melanoma Differentiation-Associated protein 5) или LGP2 (Laboratory of Genetics and Physiology 2), либо таргетирования ssRNA (Single-stranded RNA - одноцепочечная РНК), dsRNA (Double-stranded RNA - двухцепочечная РНК) вирусов или неметилированных мотивов CpG, идентифицированных в бактериях (Barbalat, R., Ewald, S.E., Mouchess, M.L. & Barton, G.M., 2011). Тем не менее было доказано, что ни один из этих рецепторов не реагирует с циклическими нуклеотидами бактерий. Учитывая эволюцию биологических организмов, логично предположить наличие рецептора, предназначенного для циклического ди-ГМФ, универсального вторичного посредника бактерий. Однако, вопрос о том, как ц-ди-ГМФ был распознан иммунной системой хозяина оставался невыясненным до открытия нового цитозольного рецептора, называемого стимулятором генов интерферона (STING, также известный как TMEM173, MPYS, MITA и ERIS).

3. Ц-ди-ГМФ-опосредованный внутриклеточный путь активации

3.1 Активация иммунной системы