2.2. Определение продолжительности осахаривания

Сущность метода основана на способности крахмала давать интенсивное синее окрашивание с йодом. В результате ферментативного гидролиза крахмала в растворе накапливаются редуцирующие сахара и декстрины. По мере уменьшения молекулярной массы декстринов изменяется интенсивность окраски от фиолетово-синей до светло-желтой окраски самого раствора йода.

Продолжительность осахаривания выражается временем в минутах, которое требуется для полного осахаривания затора при 70 С.

Приборы и материалы, необходимые для проведения анализа: стеклянная палочка; фарфоровая белая пластина; раствор йода (смесь 20 см³ 0,1н. раствора йода с 80 см³ дистиллированной воды).

Ход определения. По достижении в лабораторном заторе 70 С стеклянной палочкой отбирают из затора каплю сусла и помещают ее на фарфоровую пластинку; рядом с каплей помещают каплю раствора йода и, наклоняя пластинку, смешивают обе капли. В месте соединения капель определяют цвет смеси. Реакцию повторяют. Берут пробы сусла каждые 5 мин до тех пор, пока не установится чисто желтая окраска. Для контроля удобно на той же пластине смешать каплю дистиллированной воды с каплей йода.

Продолжительность осахаривания для светлого солода должна быть 10…20 мин, для темного – 30…35 мин.

2.3. Определение амилолитической способности солода

Метод основан на способности ферментов солода, главным образом α-амилазы, гидролизовать растворимый картофельный крахмал до декстринов.

Реактивы, необходимые для проведения анализа: фосфатный буфер рН = 4,8...4,9; раствор крахмала 10 г/дм³; раствор йода 0,1 моль/дм³; раствор соляной кислоты, 10 %.

Приготовление фосфатного буфера. В мерную колбу вместимостью 200 см³ вносят однозамещенный фосфорно-кислый калий массой 1,815 г; приливают дистиллированную воду и доводят объем до метки.

Приготовление раствора крахмала. В колбу вместимостью 100 см³ вносят навеску крахмала из расчета 1 г сухого крахмала в 100 см³ воды, приливают 25 см³ дистиллированной воды. Колбу помещают в кипящую водяную баню и выдерживают в ней до полного растворения крахмала. Затем содержимое колбы охлаждают, добавляют 10 см³ фосфатного буфера, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Приготовление рабочего раствора йода. Рабочий раствор йода готовят из основного раствора йода концентрацией 0,1 моль/дм³, разбавляя его дистиллированной водой с таким расчетом, чтобы оптическая плотность рабочего раствора, определяемая на КФК в кювете толщиной 10 мм при длине волны 550 нм, была равна 0,16. Готовят ряд стандартных растворов йода: 0,5; 0,75; 1,0; 1,5 и 2,0 см³ 0,1н. раствора йода в 100 см³ дистиллированной воды и определяют их оптическую плотность. По полученным данным строят калибровочный график и по нему для известной оптической плотности D = 0,16 определяют количество йода, которое необходимо внести в 100 см³ дистиллированной воды.

Посуда и приборы, используемые при определении амилолитической способности солода: конические колбы вместимостью 200 см³; цилиндры на 100 см³; пипетки на 1,5 и 10 см³; пробирки на 20 см³ (на одно определение требуется шесть пробирок); стеклянные палочки; водяная баня или ультратермостат; КФК; набор кювет.

2.3.1. Приготовление основного солодового раствора

Навеску тонкоизмельченного сухого солода массой 5 г помещают в коническую колбу вместимостью 200 см³, добавляют 10 см³ фосфатного буфера и 90 см³ дистиллированной воды. Полученную смесь выдерживают в водяной бане при температуре 30 С в течение 1 ч при периодическом помешивании стеклянной палочкой. Затем полученную вытяжку фильтруют и фильтрат используют в качестве основного раствора.

2.3.2. Приготовление рабочего солодового раствора

Рабочий солодовый раствор готовят, исходя из предполагаемой амилолитической способности солода (табл. 2.2).

Таблица 2.2

Приготовление рабочего солодового раствора

2.3.3. Осахаривание крахмала

Для проведения осахаривания крахмала в две пробирки наливают по 10 см³ раствора крахмала, помещают пробирки в ультратер-мостат при температуре 30 С и выдерживают в течение 5…10 мин. Затем, не вынимая пробирок из бани, наливают в первую пробирку 5 см³ дистиллированной воды (контроль), а во вторую – 5 см³ рабочего солодового раствора (опыт). Смеси сразу же перемешивают и вновь выдерживают в водяной бане еще 10 мин. По истечении указанного времени пробирки вынимают из бани, отбирают из контрольного и опытного растворов по 1 см³ реакционной жидкости и переносят в две другие пробирки с предварительно налитыми туда 10 см³ раствора соляной кислоты, прерывающей действие ферментов. Содержимое пробирок взбалтывают, от каждой пробы отбирают по 1 см³ полученного раствора и переносят в новые пробирки с предварительно налитыми 10 см³ рабочего раствора йода. Содержимое пробирок перемешивают. Контрольный раствор окрашивается в синий цвет, а опытный – в фиолетовый различной степени интенсивности.

Оптическую плотность полученных растворов определяют на КФК в кюветах толщиной поглощающего слоя 10 мм при 656 нм.

2.3.4. Обработка результатов

Количество крахмала (в граммах), подверженного гидролизу, рассчитывают по формуле

(2.3)

где D – оптическая плотность контрольного раствора; D₁ – оптическая плотность опытного раствора; 0,1 – количество крахмала, взятое на определение, г.

При 0,02 > К > 0,07 анализ повторяют, изменив разбавление рабочего солодового раствора.

Амилолитическую способность (ед./г) на воздушно-сухое вещество рассчитывают по формуле

(2.4)

2.4. Определение диастатической силы солода по методу Виндиша–Кольбаха

Диастатическая сила (ДС) солода выражается в граммах мальтозы, образовавшейся из растворимого крахмала под действием 100 г солода. Светлый солод должен обладать ДС не ниже 150; у средних по качеству солодов ДС равняется 150…200; у хороших – 200…250; у очень хороших – выше 250.

Приборы и реактивы, необходимые для проведения анализа: заторный аппарат или водяная баня; термометры; колбы; химические стаканы; пипетки; мерные колбы на 50, 200 и 100 см³; песочные часы на 5 мин. Растворимый крахмал, буферный раствор: 0,1 н. раствор йода; 0,1 н. раствор тиосульфата натрия; 1н. раствор H₂S0₄; 1 н. раствор гидроксида натрия, 1 %-й раствор крахмала.

Ход определения. Для приготовления вытяжки 20 г тонкоразмолотого сухого солода помещают в предварительно взвешенный стеклянный или заторный стакан с 450 мл дистиллированной воды и при помешивании экстрагируют 1 ч на водяной бане (в заторном аппарате) при 40 С. После этого содержимое стакана охлаждают до комнатной температуры, доводят его массу до 500 г и фильтруют через складчатый фильтр в сухую колбу.

Одновременно готовят 2 %-й раствор крахмала. Для этого 22 г растворимого крахмала (при содержании влаги 10 %) разбалтывают в 50 мл воды и взвесь тонкой струей при перемешивании вливают в 800 см³ кипящей воды. Кипение жидкости поддерживают 5 мин и охлаждают, помешивая раствор стеклянной палочкой во избежание образования на поверхности пленки. Раствор переливают в литровую мерную колбу, добавляют 5 мл буферного раствора, после чего объем содержимого колбы доводят водой до 1 л при температуре 20 С.

При выполнении основного опыта 100 см³ раствора крахмала вливают в мерную колбу на 200 см³, температуру устанавливают точно 20 С и вносят 5 см³ солодовой вытяжки, смесь выдерживают 30 мин. Реакцию прерывают, добавляя 3 см³ 1 н. раствора гидроксида натрия, после чего объем содержимого колбы доводят водой до метки.

Для определения содержания образовавшейся мальтозы 50 см³ содержимого 200 см³ колбы помещают в коническую колбу на 200…250 см³, приливают 25 см³ 0,1 н. раствора йода и 3 мл 1 н. раст-вора гидроксида натрия. Смесь перемешивают и оставляют в покое на 5 мин, затем вводят 4,5 см³ 1 н. раствора H₂S0₄ и титруют 0,1 н. раст-вором тиосульфата.

Количество израсходованного 0,1 н. раствора йода должно быть в пределах 5…15 см³, в противном случае опыт необходимо повторить с другим количеством солода.

Холостой опыт на вытяжку из солода проводят следующим способом. Так как солодовая вытяжка содержит мальтозу, на которую расходуется часть йода, то необходимо провести определение этого количества. Для этого 12,5 см³ солодовой вытяжки доливают водой до 50 см³, добавляют 25 см³ 0,1 н. раствора йода, 3 см³ 1 н. раствора NaOH и при перемешивании смесь выдерживают 5 мин, затем добавляют в нее 4 см³ 1 н. раствора H₂S0₄ и титруют 0,1 н. раствором тиосульфата натрия, добавив несколько капель раствора крахмала.

Холостой опыт на крахмал проводят следующим образом: 25 см³ буферного раствора крахмала и 25 см³ воды помещают в коническую колбу на 200…250 см³, приливают 10 см³ 0,1 н. раствора йода, 3 см³ 1 н. раствора NaOH и выдерживают 5 мин; приливают 4 см³ 1 н. раст-вора серной кислоты и титруют смесь 0,1 н. раствором тиосульфата натрия.

Диастатическую силу рассчитывают по формуле (в условных единицах Виндиша–Кольбаха)

(2.6)

где а – количество 0,1 н. раствора йода, связанного в опыте, см³; b – количество 0,1 н. раствора йода, связанного солодовой вытяжкой, см³; с – количество 0,1 н. раствора йода, связанного раствором крахмала, см³; K – коэффициент разбавления, равный двум при употреблении 20 г солода; 17,1 – число миллиграммов мальтозы, соответствующее 1 см³ 0,1 н. раствора йода.

где 6,889 и 0,029388 – коэффициенты расчетного уравнения; К – количество гидpoлизованного крахмала; n – количество солода, которое содержится в 5 см³ рабочего солодового раствора, мг.

Aмилолитическую способность (ед./г) на сухое вещество рассчитывают по формуле

, (2.5)

где W – массовая доля влаги солода, %.

Вычисления проводят до второго десятичного знака. За результат опыта принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между двумя определениями не должно превышать 0,9 ед./г.

Амилолитическая активность солода (АС) характеризуется числом единиц, содержащихся в 1 г или 100 см³ исследуемого материала. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 г растворимого крахмала в строго определенных стандартных условиях: при температуре 30 С; рН раствора 4,7…4,9; продолжительности процесса 60 мин.

Пример. Приготовлен раствор 5 г солода в 100 см³ дистиллированной воды с фосфатным буфером. Зеленый солод предположительно обладает высокой амилолитической активностью – порядка 30 ед./г. По табл. 2.2 находим количество основного раствора солода, необходимое для приготовления рабочего раствора. Оно равно 4 см³ в 100 см³. Тогда в 5 см³ рабочего раствора солода будет содержаться 10 мг солода.

При колориметрировании получены следующие значения оптической плотности: D = 0,725; D₁ = 0,388. Количество гидролизованного крахмала составит

В результате амилолитическая активность солода

или в пересчете на абсолютно сухое вещество при влажности солода 38 %

Зеленый солод хорошего качества должен иметь амилолитическую активность в расчете на сухое вещество солода в пределах 20…35 ед./г, готовый солод – 14…16 ед./г.

Пример. Влажность свежепроросшего солода 43 %. Для приготовления вытяжки взято 20 г солода. На обратное титрование избытка йода в основном опыте израсходовано 17,7 см³ тиосульфата нат-рия; следовательно, на окисление мальтозы пошло 25 – 17,7 = 7,3 см³ (a = 7,3); 12,5 см³ вытяжки потребовали 25 – 18,9 = 6,1 см³ 0,1 н. раст-вора йода (b = 6,1). Количество йода, связанного раствором крахмала, 10 – 9,3 = 0,7 см³ (c = 0,7). Тогда

В пересчете на сухое вещество

Диастатическая сила задается в единицах Виндиша–Кольбаха (Windisch–Kolbach, WK). Нормальные значения для светлого сухого солода 240…260 единиц WK, для темного солода 150…170 единиц WK.

Диастатическая сила светлого свежепроросшего солода составляет 300…400 ед./г, темного свежепроросшего – 400…500 ед./г или единиц WK.