внутрішніх і зовнішніх факторів. Відомо, що в основі реалізації генетич ної інформації лежать процеси транскрипції (синтез РНК на матриці ДНК) і трансляції (синтез білків на матриці інформаційних РНК), пору шення яких викликає модифікаційні зміни в клітині.
У природних умовах поява мутацій має випадковий характер, тобто вони є спонтанними і відбуваються мимовільно без сторонньої дії пев них факторів. Частота появи спонтанних мутацій залежить від геноти пу, віку і фізіологічного стану популяції мікроорганізмів. Спонтанні му тації відбуваються з відносно невисокою частотою, в середньому 10"® на один ген за покоління. Спонтанні мутації можуть бути наслідком внутрішньоклітинних порушень: 1) помилок реплікації і репараціїї ДНК, пошкодження вільними радикалами, донорами С Н нруп, які утворюють ся при нормальному метаболізмі клітини; 2) зміни організації й експресії генів у результаті переміщення мобільних генетичних елементів усере дині геному.
Внаслідок цілеспрямованої дії на мікробну популяцію фізичних або хімічних чинників виникають пошкодження ДНК, які приводять до індуко ваних мутацій.
Залежно від виду пошкоджень генетичного апарату виділяють такі типи мутацій: геномні, хромосомні і генні. Гвномні мутащ - це сер йозні порушення генетичного апарату, пов'язані із зміною числа хромо сом - появою додаткових колій бактеріальної хромосоми чи появою плоїдності у еукаріот. Хромосомні мутації - це зміни структури хромо сом (структурні хромосомні аберації, інверсії І транслокації), їх відносять до основної категорії індукованих мутацій. Інверсії - це внутрішньохромосомні аберації, при яких фрагменти ДНК розвертаються на 160° від носно свого нормального положення. При транслокаціях відбувається переміщення великих фрагментів ДНК з однієї ділянки бактеріальної хромосоми в іншу, обмін фрагментами транслокації. При інверсіях і транслокаціях загальна кількість генетичного матеріалу в геномі зали шається сталою, змінюється тільки його взаємне розміщення вздовж бактеріальної хромосоми.
Третій, найпоширеніший тип - генні або точкові мутації. Вони ви никають при пошкодженні ниток ДНК. Генні мутації відбуваються за різ них причин: у результаті хімічної реакції мутагену і ДНК; як наслідок по милок на рівні рекомбінації; в результаті помилок ферментів репарації; збоїв у системі реплікації ДНК.
За характером впливу на процеси транскрипції і трансляції виділя ють чотири основні категорії генних мутацій.
259
-Місенс-мутації (транзиції, трансверсії) - виникають при заміні нуклеотиду всередині кодону. Це приводить до вставки у визначеному місці поліпептидного ланцюга іншої амінокислоти. В результаті такої заміни може змінитися фізіологічна роль закодованого білкового продукту.
-Нонсен-мутацїї {транзиції, трансверсії) - виникають при появі все редині гену за рахунок заміни окремих основ, кінцевих колонів. У ре зультаті процес трансляції припиняється в місці утворення термінально
го кодону.
-Сейменс-мутацїї - відбуваються при перетворенні одного кодону на інший в межах родини вироджених крдонів, які кодують синтез однієї
ітієї ж амінокислоти. Такі мутації не змінюють характеру синтезу полі пептиду.
-Мутації зсуву рамки зчитування. Вони виникають при появі всере дині гену інсерцій і депецій. У результаті змінюється смислове зчиту
вання інформації гену в процесі синтезу білка внаслідок нових комбіна цій азотистих основ в триплетах. Триплети нуклеотидів після випадіння чи вставки набувають нового складу в результаті зсуву на одну азотисту основу. В підсумку весь поліпелтидний ланцюг після такої мутації одер жує амінокислоти абсолютно відмінні від закодованих у вихідному гені. Мутації цього типу складають значну частину спонтанних первинних пошкоджень.
Порушення в регуляторних частинах гена супроводжуються кількі сною зміною продукту і зовсім не торкаються функціональної активно сті білку. Регуляторні мутації, як правило, менш серйозні і мають більш виражений ллейотропний ефект порівняно з мутаціями в структурних генах.
В умовах зростаючого антропогенного забруднення ґрунтів існує імовірність того, що мутації в популяціях мікроорганізмів будуть накопи чуватися, їх чисельність зростатиме від покоління до покоління. Але в природі виробилися механізми, які перешкоджають накопиченню мута цій. Це не тільки вищеплювання І знищення мутантних клітин, а й меха нізми, що запобігають появі нових мутацій - процеси антимутагенезу. Антимутагенез - це генетичний гомеостаз, який забезпечує здатність клітини підтримувати функціональний стан її геному. Антимутагенез властивий усім живим клітинам.
Виділяють два рівні захисту від генотоксичної дії ендо- і екзогенних факторів. До механізмів першого рівня антимутагенезу відносять 1 - подвійну структуру спіралі ДНК, 2 - процеси зв'язування й інактивації активних продуктів метаболізму ксенобіотиків комплексом антиоксидан тів (ферментами супероксиддисмутазою і катапазою, токоферолами,
260
вітамінами А. К, С, глугаміновою і янтарною кислотами та інші), поліамінами (спермін), пуриновими рибозидами (аденозин, гуанозин), 3 - ме ханізми регулювання проникнення мутагенів через клітинні мембрани. Відбувається також метаболічна інактивація токсикантів шляхом зв'язування мутагену з антимугагенними сполуками з наступним виве денням такого комплексу з клітини. До захисних механізмів другого рів ня відносять репаративну систему клітини, яка усуває передмутаційні пошкодження ДНК, появу яких не попередили механізми першого рівня захисту.
Антимугагенез на фізіологічному рівні відбувається шляхом амплі фікації генів ферментів, які здатні руйнувати певні ксенобіотики. Амплі фікація може поширюватися на весь геном або тільки на окремі гени. Індукція ферментів репарації ДНК - це також один з адаптаційних меха нізмів клітини у відповідь на присутість мутагенного агенту.
До біоантимутаганів відносять хімічні сполуки і речовини біологічно го походження, які знижують частоту мутацій, впливаючи на процеси пе ретворення мутагенів у клітині і зв'язуючи біологічно активні радикали, які виникають у ході перетворень мутагену. Виходячи з механізмів їх дії, виділяють кілька груп антимутагенів: мембранні, метаболічні, репара ційні і антимутагени, які здатнізв'язувати вільні радикали.
Щоб подіяти на генетичні структури, генотоксичні речовини повинні подолати клітинну мембрану. Речовини, які знижують її проникність для мутагенів, називають мембранними антимутагенами, вони мають мо дифікуючий вплив на процес мутагенезу. До мембранних антимутагенів належать речовини стероїдної природи, насамперед - холестерол, який є основним компонентом лігтопротеїнів зовнішньої клітинної мембрани. Підвищення синтезу хопестеролу утруднюює трансмембранний транс порт мутагену.
У незначних кількостях вільні радикали утворюються і при норма льному метаболізмі клітини. До них належать: супероксид-аніон 0 2~,
гідроксип-аніон ОН- І пероксид водню (як основне джерело вільних ра дикалів). Захист клітин від їх руйнівної дії здійснюється антиоксидант ною системою. Вона включає як низькомолекулярні антиоксиданти (ас- корбат-іон, ретиноли, токофероли, урати, каротини), так і антиоксидант ні ферменти. Виділяють три ЛІНІЇ захисту клітини на рівні ферментних систем: 1) супероксиддисмугаза; 2) глутатіонпероксидаза і каталаза; 3) система глутатіонтрансферази, система фосфоліпідгідропероксидглутатіонпероксидази.
Речовини, які активують систему репарації ДНК, називаються репараційними антимутагенами. Вони підвищують точність ДНК-реп- лікації, інтенсифікують процеси репарації ДНК. Необхідною умовою
261
репарації ДНК е рекомбінація між інтактною ниткою ДНК і пошкодже ною.
Наявість механізмів адаптації на сьогодні не захищає мікробні угру повання від тиску на їх генофонд мутагенів антропогенного походження. Кількість генетично активних речовин, накопичених сьогодні в середо вищі [снування на кілька порядків перевищує ту. з якою мікроорганізмам доводилось зіткнутись раніше в природних незабруднених умовах, по відношенню до яких і сформувались механізми адаптації.
Високий рівень забруднення довкілля вимагає всебічного вивчення не тільки їх токсичних властивостей, а й можливого мутагенного ефекту. Постає проблема розробки методів дослідження мутагенної активності хімічних засобів захисту рослин і попередження генетичних наслідків від їх застосування. Для того щоб ефективно виявляти присутність генети чно активних речовин у ґрунті, потрібні ефективні тест-системи, які би відображали реальну безпечність або небезпечність полютантів для мікробної клітини.
На сьогодні запропоновано біля 100 тест-систем різного рівня, багато з яких добре розроблені в методичному плані і досить широко застосовуються як для виявлення мутагенів, так і для оцінки їх гене тичної активності. Кожна тест-система специфічна, тому досліджува на хімічна речовина може виявитися мутагенною в одній системі і не мутагенною в інших.
У багатьох бактеріальних тест-системах використовують, в осно вному, два типи клітин: клітини з нормальною здатністю до репарації пошкоджень ДНК і клітини, в яких відсутня певна ланка в метаболічному шляху, відповідальному за репарацію ДНК. Переважна загибель дефек тних по репарації штамів в результаті д ії хімічного агенту означає, що останній реагує з ДНК і тому може бути мутагенним. Це основний прин цип більшості мікробіологічних тестів.
Бактеріальні тест-системи набули широкого використання завдяки високій швидкості росту, короткій тривалості генерації бактерій І невели ким матеріальним витратам на проведення аналізу. Крім того, виявлено кореляцію між результатами генотоксичної д ії мутагенів на бактеріальну клітину і на соматичні клітини культур тканин тварин і людини.
За даними міжнародних організацій (IRAC і ін.), найпоширенішим у світі бактеріальним тестом для виявлення генотоксичності досліджува них агентів є тест Еймса. У зв'язку з високою репрезентативністю ре зультатів тестування, він використовується більш як у 2000 лабораторі ях світу. Для індикації генетичних подій під дією мутагенів у тесті Еймса використовуються зворотні мутації від ауксотрофності до прототрофності в гістидиновому опероні в клітинах бактерій Salmonella typhimurium
262
штамів ТА97, ТА98, ТА100, ТА102, ТА104, ТА1535, ТА1537 ТА1538. Во ни дозволяють визначити, які саме зміни в ДНК індукуються тим чи ін шим мутагенним агентом. Штами ТА97, ТА98, ТА100, ТА1535, ТА1537 дефектні по репарації завдяки делецІЇ в гені uvr В, їх використовують для виявлення мутагенів, здатних пошкоджувати системи репарації. Ген uvr В, кодуючи реларативні ферменти для видалення тимінових димерів, контролює систему ексцизійноТ репарації. Штами ТА97, ТА98, ТА1537 несуть мутацію типу зсуву рамки зчитування в his-олероні, а ТА100 - мутацію типу заміни пар азотистих основ. Штами S.typhimurium ТА102 і Т А КИ мають реверсії з записами стоп-кодонів. Вони особливо чутливі до д ії альдегідів і кетонів і дозволяють виявити перебудови аль дегідних і кетогруп в ДНК. Усі штами сальмонел несуть мутацію гіа, яка відповідає за порушення проникності клітинної стінки і пов’язану з цим відсутність капсули. Це знижує вірулентність штамів і забезпечує краще проникнення мутагенів у клітину. Штами Salmonella typhimurium ТА100 і ТА98 мають плазміду рКМ101 (R-фактор), яка відповідає за стійкість клітин до ампіциліну.
Найпоширенішими у лабораторній практиці стали штами ТА97, ТА98, ТА100, ТА102 завдяки їх чутливості до широкого спектру мутаге нів. А штами ТА98 і ТА100 показали найкращі результати при перевірці антропогенних забруднень водойм і фунтів.
Вже впроваджено в генетичні дослідження нові штами - Salmonella typhimurium IG1012, IG1021, IG1024, NM2009 з підвищеною активністю о-ацетилтрансферази. Ці штами чутливі до д ії гетероциклічних і арома тичних амінів і їх похідних. Інша група нових штамів - TA98NR, ТА98/1- DNP6 - мають підвищену активність нітратредукгази. Ці мікроорганізми чутливі до мутагенноїдії нгтро- і амінопохідних ароматичних вуглеводнів.
Для індикації мутагенної д ії використовують також штами Escherichia соіі, які несуть генетичні маркери. Так, наприклад, штами
Є. соіі WP2, WP2 uvrA, WP2(pKM101), WP2 uvrA (рКМЮ І) несуть мута цію в трилтофановому олероні. Кишкова паличка використовується і в тесті на індукцію профага. При д ії на клітини бактерій генетично актив ними речовиними індукується SOS-відповідь на пошкодження в полінуклеотидних ланцюгах. Виявом SOS-відповіді є індукція профага всере дині клітин Є соіі в результаті пошкодження репресора профага.
Штами Е. соіі використовуються І в SOS-хромотесті. SOS-відповідь клітин проявляється в експресії генів, які входять до системи репарації. Найважливішими у цьому процесі є два гени: /ех А - надує білокрепресор майже 20 генів, відповідальних за репарацію; гас А - кодує копротеазу, яка нейтралізує репресора і включає репарацію. Мірою мута генності в даному тесті теж виступає активність р-галактозидази, яка
263