Существует ряд путей предвидения малых молекул, которые могут влиять на нейротрофиновый сигналинг. Соединения могут активировать Trk-рецепторы непосредственно или опосредованно или каким-либо образом усиливать активацию эндогенных нейротрофинов, которые могут присутствовать в концентрациях меньших оптимальных, in vivo при нейродегенеративных заболеваниях. Альтернативно, соединения могут повышать до нормального уровня экспрессию эндогенных нейротрофинов посредством действия на соответствующие механизмы транскрипции. Наконец, соединения могут оказывать влияние на сигнальные пути, которые активирует Trk-рецепторы или по-другому активировать нейротрофиновые эффекты [31].
Существует ряд сообщений, описывающих низкомолекулярные соединения, которые способны действовать как непосредственные активаторы Trk-рецептора. Циклопептидный димерный лиганд, по структуре соответствующей аминокислотной последовательности 92-97 NGF, действовал как частичный агонист TrkА. Наблюдались также небольшие эффекты с мономерным вариантом циклического пептида. Сходные данные получены для циклического варианта последовательности 92-96 NGF. Есть также данные о пептидных миметиках NT-3, причём у них также, как и у пептидных миметиков NGF, димерный циклический вариант во всех случаях оказывался активнее мономерного. Существует ещё ряд примеров низкомолекулярных соединений - миметиков непептидной природы, обладающих активностями нейротрофинов, но, несмотря на это, ни одно из них не прошло всех испытаний, необходимых для того, чтобы стать лекарством. [31].
6. Миметики BDNF
Создание соединений с физико-химическими свойствами, отличными от нейротрофинов, но способных селективно взаимодействовать с нейротрофиновыми рецепторами рассматривается как важное направление получения препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний [17,39,40].
Таким образом, на сегодняшний день получены биологически активные низкомолекулярные миметики BDNF, представляющие собой конформационно ограниченные циклические пептидные аналоги его петлеобразных участков, способные связываться с TrkA и p75 рецепторами in vitro. Однако число полученных миметиков невелико и развитие этой области пептидной химии только началось.
3. Достижения в синтезе миметиков BDNF.
На данный момент множество учёных и лабораторий по всему миру занимаются синтезом низкомолекулярных миметиков BDNF. Однако реальных успехов достигли всего три группы.
Группой австралийских исследователей сконструирован следующий ряд миметиков: мономерные моноциклические пептиды с антагонистической активностью на основе 1-й, 2-й и 4-й петель [2,3]; димерные бициклические и трициклические пептиды на основе 2-й петли с агонистической активностью [4]; циклопентапептид на основе трипептидного фрагмента 4-й петли -Lys-Lys-Arg-, созданный как лиганд р75 рецептора и усиливающий выживаемость сенсорных нейронов in vitro [5], и его липофильные производные [6].
Наши американские коллеги [7] путем имплантации фрагментов BDNF в структуру NGF нашли участок 2-й петли, -Ser-Lys-Gly-Gln-Leu-, вовлеченный в специфичное взаимодействие BDNF с trkB. На основе этой структуры была высказана фармакофорная гипотеза и методом виртуального скрининга с её использованием было просеяно 35 миллионов описанных соединений, выявлено 1785 соединений-кандидатов, число которых было уменьшено до 14 на основе критериев молекулярного веса и доступности фармакофорной части для взаимодействия с рецептором. Из этих 14 соединений 7 было коммерчески доступными. После тестирования in vitro на клеточных моделях было отобрано одно соединение на основе 1,3,5-бензолтрикарбоновой кислоты (LM22A-4). Для последнего при интраназальном введении была показана способность восстанавливать нарушенную травмой мозга пространственную память у крыс.
Ранее в НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН был получен димерный дипептидный аналог 4-й петли BDNF - ГСБ-106, дипептидный фрагмент которого соответствовал центральному фрагменту бета-изгиба 4-й петли (-Ser94-Lys95-). Он обладает in vitro нейропротективной активностью в концентрациях 10-5 - 10-8 М. Для изучения влияния природы аминокислотных остатков в структуре миметика ГСБ-106 на активность, был проведен его глициновый скан. Целью данной работы является синтез глицинсодержащего миметика нейротрофина BDNF ГТ-105.
Рисунок 4. [Suc-L-Ser-L-Lys-NH(CH2)3-]2 (ГСБ-106)
информон клеточный нейротрофический спинной
Синтез гексаметилендиамида бис-(моносукцинил-серил-глицина) (HOOC-(СН2)2-СO-Ser-Gly-NH-)2(CH2)6, ГТ-105
Рисунок 5
Boc-Gly-OH. К раствору 1.50 г (20 ммоль) Gly-OH в 15мл 2н NaOH добавляли раствор 4,2 г NaHCO3 в 40мл воды и 20мл диоксана, Затем добавляли раствор 7 г (32.11 ммоль) ди-трет-бутилпирокарбоната в 10 мл диоксана. Смесь перемешивали 3 ч при комнатной температуре, затем добавляли 50 мл воды. Избыток ди-трет-бутилпирокарбоната экстрагировали петролейным эфиром (3х40 мл). Водный раствор подкисляли 30мл раствора 3% H2SO4 (7г) и, т.к. pH не дошел до необходимого значения, равного 3 (по универсальному индикатору), то порциями добавляли кристаллическую лимонную кислоту (7 г). Затем экстрагировали продукт этилацетатом (2х30мл), высушивали над Na2SO4. Растворители удаляли в вакууме. Остаток, в виде желтого маслообразного вещества, затирали под 10 мл гексана, кристаллы отфильтровывали, сушили в вакууме. Выход 3.32 г (95%). Rf 0.74 (хлороформ-метанол-вода-уксус. к-та, 15:10:2:3). т.пл. 88-89oC - лит. [Гершкович, Кибирев, 1982] т.пл. 87-88oC. Спектр 1Н-ЯМР в ДМСО-d6, , м.д.: 1.38 (м, 9Н, (CH3)3C-O-C(O)-), 3.57 (м, 2Н, СН2 Gly), 7.07 (т, Н, -NH Gly, J3=6,6).
Побочный продукт реакции - непрореагировавший ди-трет-бутилпирокарбонат, который удаляют экстракцией петролейным эфиром. Лимонная кислота растворяется частично в этилацетате и может загрязнить продукт, её удаляют промыванием этилацетатного раствора водой.
Boc-Gly-OSu. К раствору 2.10 г Boc-Gly-OH (12 ммоль) и 2.12 г N-оксисукцинимида (18.43 ммоль) в 30 мл ТГФ добавляли при 00С 3.81 (18.49 ммоль) ДЦГК в 20 мл ТГФ. Реакционную массу перемешивали 2 ч 20 мин при 00С и оставляли на 15 ч при +4С. Образовавшийся осадок отфильтровывали, растворитель отгоняли на роторном испарителе до 1/5 первоначального объема, остаток последовательно промывали 5% NaHCO3 (2х40мл), водой (2х40мл), высушивали над Na2SO4. Осушитель отфильтровывали, растворитель удаляли в вакууме. Остаток перекристаллизовывали из изопропилового спирта. Получали 2.59 г (75%) продукта в виде белых кристаллов. Rf 0.60 (хлороформ-метанол, 9:1), т.пл. 165-167C.
Спектр 1Н-ЯМР в ДМСО-d6, , м.д.: 1.38 (м, 9Н, (CH3)3C-O-C(O)-), 2.42 (м, 8H, -CH2CH2-, Suc), 3.57 (м, 2Н, СН2 Gly), 7.07 (т, Н, -NH Gly)
Побочный продукт реакции - дициклогексилмочевина, от которой избавляются отфильтровыванием охлажденного раствора ТГФ и затем во время перекристаллизации продукта из изопропилового спирта.
(Boc-Gly-NH-)2(CH2)6. К раствору 637 мг (5.49 ммоль) гексаметилендиамина в 12 мл ДМФА прибавляли раствор 2.20 г (12.64 ммоль) Boc-Gly-OSu в 5 мл ДМФА. Реакционную массу перемешивали в течение 3 ч, после чего выдерживали 15 ч при комнатной температуре. Затем к реакционной массе прибавляли 0.5 мл DMAPA (диметиламинопропиленамин) и перемешивали в течение 30 мин, упаривали до маслообразного состояния, после чего разбавляли 100 мл этилацетата. Органическую фазу промывали нас. NaCl (2х30 мл), водные фракции объединяли и промывали 50 мл этилацетата. Этилацетатные растворы объединяли, последовательно промывали 3% H2SO4 (2х50 мл), 3% K2CO3 (2x50 мл) и нас. NaCl (2х50 мл), сушили безводным Na2SO4 и упаривали. Получали 2.16 г (85%) продукта в виде бежевого порошка. Rf 0.45 (хлороформ-метанол, 9:1). т.пл. 55-57C.
Спектр 1Н- ЯМР (ДМСО-d6): 1.10-1.40 (м, 8H, -NHCH2(CH2)4CH2NH-), 1.37 (м, 9Н, (CH3)3C-O-C(O)-), 3.03 (м, 4Н, -NHCH2(CH2)4CH2NH-), 3.57 (м, 4Н, СН2 Gly), 7.05 (т, Н, -NH Gly, J3=6,6), 7.68 (т, 2Н, -NH(CH2)6NH-)
Побочный продукт реакции - оставшийся в избытке активированный эфир Boc-Gly-Osu, который конденсируют с DMAPA, имеющим открытую и третичную аминогруппы, при этом образовавшееся соединение легко растворяется в водной и водной подкисленной среде, что дает возможность отделения избытка исходного эфира.
[TFA*H-Gly-NH-(CH2)3-]2. Раствор 1.40 г (6.14 ммоль) [Boc-Gly-NH-(CH2)3]2 в 15 мл трифторуксусной кислоты перемешивали в течение 1 ч, затем упаривали 3 раза с порциями эфира по 20 мл. Полученную пену (затвердевшее масло) продукта затирали под эфиром и оставляли на 12 ч. Получали 1.24 мг (80%). Rf 0.10 (хлороформ-метанол-вода-уксус. к-та, 15:10:2:3), т.пл. 87-90°С. Спектр 1Н- ЯМР (ДМСО-d6): 1.27 и 1.41 (два м, 8H, -NHCH2(CH2)4CH2NH-), 3.50 (м, 4Н, СН2 Gly), 8.05 (шс, 6Н, -NH3+ Gly), 8.34 (шс, 2Н, -NH(CH2)6NH-)
[Boc-Ser(Bzl)-Gly-NH-(CH2)3]2. К раствору 1,00 г (2.18ммоль) [TFA*H-Gly-NH-(CH2)3]2 в 25 мл ДМФА сначала прибавляли 0.41 мл (1.38 ммоль) диизопропилэтиламина, а затем 595 мг (1.58 ммоль) (полученный ранее в лаборатории). Реакционную смесь перемешивали 5 ч при комнатной температуре, после добавляли 0.5 мл DMAPA, перемешивали 20 мин. Далее разбавляли 70 мл этилацетата, последовательно промывали по 30 мл: водой, 3% H2SO4, 2% K2CO3 и снова водой, сушили безводным Na2SO4 и упаривали. Полученный кристаллический остаток перекристаллизовывали из этилового спирта. Получали 970 мг (75%) продукта в виде белого порошка, Rf 0.30 (хлороформ-метанол, 9:1), Rf 0.60 (бутанол-уксусная к-та-вода, 4:1:1), т.пл. 155-157°С. Спектр 1Н- ЯМР (ДМСО-d6):
1.10-1.40 (м, 8H, -NHCH2(CH2)4CH2NH-), 1.38 (м, 9Н, (CH3)3C-O-C(O)-), 2.98 (м, 4Н, -NHCH2(CH2)4CH2NH-), 3.60 (м, 4Н, СвH2 Ser), 3.65 (м, 4Н, СН2 Gly), 4.20 (м, 2Н, СбH Ser), 4.50 (с, 4Н, ОСH2 Ser), 7.05 (т, Н, -NH Gly, J3=6,6), 7.68 (т, 2Н, -NH(CH2)6NH-)
На этой стадии побочным прдуктом реакции является избыточный Boc-Ser(Bzl)-Osu, который переводили также в водорастворимое соединение с помощью DMAPA, а также побочным является трифторуксусная соль диизопропилэтиламина также уходящая в водную фракцию при промывке водой, 3% H2SO4, 2% K2CO3.
[TFA-Ser(Bzl)-Gly-NH-(CH2)3]2. Раствор 832 мг [Boc-Ser(OBzl)-Gly-NH-(CH2)3]2 в 5 мл трифторуксусной кислоты перемешивали в течение 40 мин, после чего реакционную массу упаривали. К остатку трижды прибавляли по 20 мл эфира и снова упаривали. Полученное масло закристаллизовать не удалось. Получали 702 мг (85%) в виде коричневого масла. Rf 0.15 (хлороформ-метанол-вода-уксус. к-та, 15:10:2:3). Спектр 1Н- ЯМР (ДМСО-d6):
1.18-1.42 (м, 8H, -NHCH2(CH2)4CH2NH-), 3.03 (м, 4Н, -NHCH2(CH2)4CH2NH-), 3.74 (м, 4Н, СвH2 Ser), 3.68 (м, 4Н, СН2 Gly), 4.10 (м, 2Н, СбH Ser), 4.54 (с, 4Н, ОСH2 Ser), 7.24-7.40 (м, 10H, -C6H5 Ser), 7.91 (т, 2Н, -NH(CH2)6NH-), 8.27 (шс., 6H, NH3+ Ser), 8.71 (т, 2Н, NH Gly)
[Suc-Ser(Bzl)-Gly-NH-(CH2)3]2. К раствору 680 мг (0.87 ммоль) [TFA*H-Ser(OBzl)-Gly-NH-(CH2)3]2 в 5 мл ДМФА добавляли 0.40 мл (2 ммоль) диизопропилэтиламина, перемешивали 20 мин, затем добавляли 0.408 г (3.54 ммоль) янтарного ангидрида. Реакционную смесь перемешивали 4 ч, оставляли на 12 ч. По исчезновению исходного соединения (ТСХ контроль) реакционную массу выливали в холодную воду, осадок не выпадал, мутный раствор упаривали, затем снова выливали в холодную воду, выпавший белый осадок отфильтровали, промывали водой, высушивали над хлористым кальцием в вакууме. Получали 550 мг (90 %) Rf 0.40 (пиридин-вода-уксусная кислота-этилацетат, 20:11:6:120) т.пл. 152-154 °С
Спектр 1Н- ЯМР (ДМСО-d6): 1.08-1.41 (м, 8H, -NHCH2(CH2)4CH2NH-), 2.43 (м, 8H, -CH2CH2- Suc), 2.95 (м, 4Н, -NHCH2(CH2)4CH2NH-), 3.59 (м, 4Н, СвH2 Ser), 3.66 (м, 4Н, СН2 Gly), 4.43 (м, 2Н, СбH Ser), 4.50 (с, 4Н, ОСH2 Ser), 7.20-7.49 (м, 10H,-C6H5 Ser), 7.49 (т, 2Н, -NH(CH2)6NH-), 8.27 (т, 2Н, NH Gly), 8.30 (д, 2H, NH Ser)
От побочных продуктов - трифторуксусной соли диизопропилэтиламина и янтарной кислоты отделялись водой, в которой растворимы примеси и не растворяется нужный нам [Suc-Ser(Bzl)-Gly-NH-(CH2)3]2.
[Suc-Ser-Gly-NH-(CH2)3]2. В 30 мл метанола суспензировали 450 мг [Suc-Ser(Bzl)-Gly-NH-(CH2)3]2, добавили 300 мг 10% Pd/C, затем перемешивали в атмосфере водорода в течение 8 ч. Катализатор отфильтровывали, раствор упаривали, получали белое вспененное масло, которое дважды упаривали с 5 мл диэтилового эфира, затем высаживали диэтиловым эфиром из раствора продукта в метаноле, получившиеся кристаллы гигроскопичны, снова растворили в метаноле (растворимость хуже чем ранее) и упарили, сушили над хлористым кальцием в вакууме. Получали 340 мг (88%) в виде белого порошка. Rf 0.35 (хлороформ-метанол-вода-уксус. к-та, 15:10:2:3), т.пл. 149-151 °С. Спектр 1Н- ЯМР (ДМСО-d6): 1.15-1.44 (м, 8H, -NHCH2(CH2)4CH2NH-), 2.42 (м, 8H, -CH2CH2-, Suc), 3.02 (м, 4Н, -NHCH2(CH2)4CH2NH-), 3.57 (м, 4Н, СвH2 Ser), 3.63 (м, 4Н, СН2 Gly), 4.16 (м, 2Н, СбH Ser), 7.57 (т, 2Н, -NH(CH2)6NH-), 8.13 (д, 2H, NH Ser), 8.15 (т, 2Н, NH Gly)
В процессе гидрогенолиза бензильная защита с гидрокси-группы серина превращается в CO2 и толуол, которые легко удаляются упариванием метанольно-толуольного раствора продукта.
Список литературы
1. Папсуевич О.С., Чипенс Г.И., Михайлова С.В.// Нейрогипофизарные гормоны. - Рига: Зинатне, 1986.
2. Crowley C., Spencer S.D., Nishimura M.C., Chen K.S., Pitts-Meek S., Armanini M.P., Ling L.H., McMahon S.B., Shelton D.L., Levinson A.D. // Mice lacking nerve growth factor display perinatal loss of sensory and sympathetic neurons yet develop basal forebrain cholinergic neurons. // Cell. 1994. V. 76(6). P. 1001-1011.
3. Smeyne R.J., Klein R., Schnapp A., Long L.K., Bryant S., Lewin A., Lira S.A., Barbacid M. Severe sensory and sympathetic neuropathies in mice carrying a disrupted Trk/NGF receptor gene. // Nature. 1994. V. 368. P. 246-249.
4. Gnahn H., Hefti F., Heumann R., Schwab M.E., Thoenen H. / NGF mediated increase of choline acetyltransferase (ChAT) in the neonatal rat forebrain: evidence for a physiological role of NGF in the brain? // Brain Res. 1983. V. 285(1). P. 45-52.