Полная исследовательская публикация _______ Огородникова А.В., Мухитова Ф.К. и Гречкин А.Н.
110 _____ http://butlerov.com/ ______ ©--Butlerov Communications. 2015. Vol.41. No.3. P.109-114. (English Preprint)
Особенности биосинтеза оксилипинов в плаунке семейства Selaginellaceae
Оксилипины составляют большой класс биологически активных соединений - продуктов окислительного метаболизма жирных кислот [1]. Как водоросли [2, 3], так и наземные растения [4, 5] имеют большой набор липоксигеназ, которые катализируют диоксигенирование полиненасышенной жирной кислоты в гидроперекиси, которые, в свою очередь, претерпевают различные вторичные превращения. Эти превращения контролируются неклассическими ферментами P450 семейства CYP74, которые описаны для цветковых растений [6, 7]. Ферменты клана CYP74 недавно обнаружены в некоторых протеобактериях и метазоа [8, 9]. В настоящее время известно четыре типа ферментов CYP74 [6, 7, 10]: алленоксидсинтаза (AOС), гидропероксидлиаза (ГПЛ), дивинилэфирсинтаза (ДЭС) и эпоксиалкогольсинтаза (ЭАС). Многие оксилипины, которые синтезируются в ходе липоксигеназного метаболизма, имеют большое значение для клеточного сигналлинга и защиты растений [4, 6].
Липоксигеназный путь и оксилипины нецветковых наземных растений гораздо менее изучены, чем у цветковых. Недавние работы по Physcomitrella patens [11-15] скорее исключение. Чтобы восполнить существующий пробел, мы предприняли настоящую работу по изучению липоксигеназного метаболизма в плаунке Selaginella martensii. Мы обнаружили, что в надземных частях S. martensii реализуется 13-липоксигеназное направление и проявляется ДЭС и АОС активности. При катализе этими ферментами образуется значительное коли-чество оксилипинов, они были идентифицированы и описаны в данной работе. В данной статье впервые описан липоксигеназный путь в плаунке, входящем в отдел Lycopodiophyta, который включает древнейшие существующие сосудистые растения.
Растения S. martensii, выращенные в комнатных условиях, были заказаны в Нидерландах и приобретены в магазине города Казани. Линолевая и б-линоленовая кислоты были приобретены у компании Sigma (США). Катализатор Адамса и силилирующие реагенты были приобретены у Fluka (Швейцария).
Листья и стебли селагинеллы (навески массой 15 г.) измельчали в охлаждённой ступке в холодной смеси растворителей (+4°С) гексанэтилацетат (1:1). Далее экстракт растворяли в смеси хлороформ - изопропанол (2:1) и пропускали через патрон с аминным картриджем Supelclean LC-NH2 (Supelco, Bellefonte, PA, USA). Затем вещества с картриджа элюировали смесью этилацетат - уксусная кислота (98:2) и подвергали этерификации диазометаном, с последующим силилированием. Полученные Ме/ТМС производные анализировали методом газовой хроматомасс-спектрометрии электрон-ного удара (GCMS-QP5050A, колонка OPTIMA-5 MS (30 мЧ0.25 мм) в режиме программирования температуры 120 оС - 240 оС.
Был изучен профиль оксилипинов в плаунке Selaginella martensii Spring. Надземные зеленые ткани S. martensii были проэкстрагированы, прометилированы и просиланизированы. Эти МеТМС производные были проанализированы методом газовой хроматомасс-спектрометрии. Анализ показал, что в образце плаунка содержится целый ряд оксилипинов. Структурные формулы двух основных групп оксилипинов - дивиниловых эфиров и циклопентенонов приведены на рис. 1а, б. Хроматограммы по полному ионному току представлены на рис. 2.
а) б)
Рис. 1. Структурные формулы дивиниловых эфиров (а) и циклопентенонов (б), обнаруженных в плаунке Selaginella martensii
Время удерживания, мин
Рис. 2. Хроматограммы оксилипинов (Ме/ТМС) плаунка Selaginella martensii по полному ионному току
В масс-спектрах основных оксилипинов 1-3 и 4-9 имеется молекулярный ион М+ при значении m/z 308 и 306 соответственно (рис. 3). Соединения 1-3 имеют сходные масс-спектры, см., например, спектр соединения 2 (рис. 3а). Их спектры полностью соответствуют спектрам этеролевой кислоты (Ме эфиры) и ее геометрическим изомерам [16-18]. Оксилипины 5-7 (M+ при m/z 306) также имеют идентичные масс-спектры. Спектр соединения 7 приведен на рис. 3б. Спектры соединений 5-7 соответствуют спектрам этероленовой кислоты (Me эфир) и ее геометрическим изомерам [16-18].
Рис. 3. Масс-спектр электронного удара и схемы фрагментации дивиниловых эфиров 2 (а) и 7 (б) плаунка Selaginella martensii
В масс спектрах соединений 4, 8 и 9 также присутствует молекулярный ион M+ с m/z 306. Соединения 4 и 8 имеют идентичные спектры. Масс спектр соединения 8 представлен на рисунке 3а. Спектр соответствует cis-12-oксo - 10,15 (Z) - фитодиеновой кислоте (12-oксo-ФДК) Me эфир [19]. Масс спектры и времена удерживания соединений 4 и 8 соответствуют таковым для trans-12-оксо-ФДК и cis-12-oксo-ФДК (Me эфиры), соответственно. Масс спектр соединения 9 имеет другую фрагментацию (рис. 4б), соответствующую 12-oксo-9 (13), 15 (Z) - фито-диеновой кислоте (Me эфир) [20]. В условиях каталитического гидрирования соединение 9 превращается в эквимолекулярную смесь trans и cis изомеров 12-оксофитоновой кислоты (Me). В этом масс спектре имеем M+ с m/z 310 (0.1%), [M+ - MeO] с m/z 279 (1%), [M+ - Me(CH2)4 + H] с m/z 240 (4%), [M+ - (CH2)7COOMe] с m/z 153 (14%), 83 (100%). Аналогично, при гидрировании соединений 4 и 8 образуются trans и cis изомеры12-оксофитоновой кислоты (Me). Полученные результаты позволяют нам приписать структуры Me эфиров trans-12-oксo-ФДК, cis-12-оксо-ФДК и 12-оксо-9 (13) - ФДК соединениям to 4, 8 и 9, соответственно.
Пик одного из минорных соединений 10 элюируется вскоре после метилстеарата (не представлено) и, несмотря на его относительно малое содержание, представляет определенный интерес. Его масс-спектр представлен на рис. 4в. Схема фрагментации показана там же. Молекулярный ион с m/z 278 и характеристические фрагменты дают возможность идентифицировать соединение 10 как cis - 2,3 - динор-12-oксo-ФДК, более короткий гомолог соединения 8 [21]. Каталитическое гидрирование соединения 10 приводит к образованию практически эквимолярной смеси trans и cis изомеров 2,3 - динор-12-оксофитоновой кислоты (Me). В их масс спектрах имеются следующие фрагментарные ионы: [M+ - MeO] - m/z 279 (1%), [M+ - Me(CH2)4 + H] - m/z 212 (7%), [M+ - (CH2)7COOMe] - m/z 153 (15%), 83 (100%).
Наряду с выше описанными продуктами дивинилэфирсинтазы и алленоксидсинтазы, детектируются и некоторые другие оксилипины, такие как 9-оксононановая кислота, азелаи-новая и (3Z) - травматиновая кислоты. Их характеристики идентичны (не представлено) таковым, описанным в нашей недавней публикации [22]. Появление таких короткоцепочечных со-единений связано, по-видимому, с гидропероксидлиазной активностью в образце S. martensii.
Рис. 3. Масс-спектр электронного удара и схемы фрагментации циклопентенонов 8 (а), 9 (б) и 10 (в) плаунка Selaginella martensii.
Полученные нами результаты показывают, что S. martensii обладает высокой 13-липоксигеназной активностью, также высокоактивны ферменты, метаболизирующие гидроперекиси жирных кислот - ДЭС и АОС. В образцах ткани S. martensii содержится большое количество оксилипинов, в том числе, геометрические изомеры этеролевой (1-3) и этероленовой (5-7) кислот, а также три изомера 12-oксофитодиеновой кислоты (4, 8, 9) и ее низко-молекулярный гомолог - cis - 2,3 - динор-12-oксo-ФДК (10).
AOСинтазные продукты обнаруживались во мхах и раньше. Например, 12-оксо-ФДК (8) была найдена во мхе Leucobryum scabrum [23]. Изомерная 12-oксo-9 (13) - ФДК (9) была выделена из образцов мха Dicranoloma scabrum и Dicranum majus [23,24]. Более того, 6,6,7,7 - тетрадегидро-12-oксo-ФДК был обнаружен во мхах Dicranum scoparium и Dicranum japonicum [24]. Еще одно родственное соединение 5,6,6,7 - тетрадегидро-12-оксо-9 (13) - ФДК было обнаружено в D. japonicum и Dicranoloma scabrum [24]. Следует отметить, что 12-оксо-9 (13) - ФДК (9) детектировалось, как минорный продукт алленоксидсинтазы в некоторых высших растениях, например, в подвергнутых стрессу листьях ячменя [25] и бобах (Phaseolus lunatus L.) [15].
Алленоксидсинтазы [13, 26], так же как и алленоксидциклазыa Physcomitrella patens, не-давно были клонированы [27]. Циклазный продукт, (9S, 13S) - 12-оксо-ФДК является предшественником жасмоната у цветковых растений [3, 4]. Существование этого метаболического пути и присутствие жасмоната во мхах дискуссионно. Так, согласно [13,28], метилжасмонат был обнаружен в P. patens. Напротив, в работе [14,29] метилжасмонаты не были детектированы в этом объекте. Не обнаружили их и мы в плаунке S. martensii в настоящей работе.
Дивиниловые эфиры играют важную защитную роль в жизни растений. ДЭС были обнаружены у многих цветковых растений DESs [6, 10]. С другой стороны, не все секвенированные геномы растений содержат гены ДЭС. Обнаружение дивиниловых эфиров в S. martensii расширяют наши знания о распространении ДЭС. Ранее дивиниловые эфиры были найдены в образцах красных [30] и коричневых водорослей [31]. Таким образом, плаунки являются промежуточным звеном между водорослями и цветковыми растениями.
Геном of S. martensii до сих пор не секвенирован. Секвенированный геном родственного плаунка Selaginella moellendorffii включает некоторые гены ферментов клана CYP74 (под-семейства J, K, L и M) и липоксигеназы. Еще предстоит клонировать эти гены и изучить кодируемые ими рекомбинантые белки.
Плаунки принадлежат к наиболее примитивным наземным растениям. Однако, результаты настоящей работы, так же как и литературные данные по Physcomitrella, показывают, что нецветковые наземные растения, несмотря на их «примитивность» обладают своеобразным липоксигеназным каскадом. Наши данные показывают, что ферментативный аппарат липоксигеназного каскада в растениях не претерпел существенных изменений в ходе эволюции.
Литература
липоксигеназный метаболизм плаунок оксилипин
[1] W.H. Gerwick, M. Moghaddam, M. Hamberg. Oxylipin metabolism in the red alga Gracilariopsis lemaneiformis: mechanism of formation of vicinal dihydroxy fatty acids. Arch. Biochem. Biophys. 1991. No.290. P.436-444.
[2] W.H. Gerwick. Structure and biosynthesis of marine algal oxylipins. Biochim. Biophys. Acta. 1994. No.1211. P.243-255.
[3] A. Andreou, F. Brodhun, I. Feussner. Biosynthesis of oxylipins in non-mammals. Prog. Lipid Res. 2009. No.48. P.148-170.
[4] A.N. Grechkin. Recent developments in biochemistry of the plant lipoxygenase pathway. Prog. Lipid Res. 1998. No.37. P.317-352.
[5] E.H. Oliw. Plant and fungal lipoxygenases. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2002. No.68-69. P.313-323.
[6] R.K. Hughes, S. De Domenico, A. Santino. Plant cytochrome CYP74 family: biochemical features, endocellular localisation, activation mechanism in plant defence and improvements for industrial applications. ChemBioChem. 2009. No.10. P.1122-1133.
[7] A.R. Brash. Mechanistic aspects of CYP74 allene oxide synthases and related cytochrome P450 enzymes. Phytochemistry. 2009. No.70. P.1522-1531.
[8] D.-S. Lee, P. Nioche, M. Hamberg, C.S. Raman. Structural insights into the evolutionary paths of oxylipin biosynthesis enzymes. Nature. 2008. No.455. P.363-370.
[9] D.R. Nelson, J.V. Goldstone, J.J. Stegeman. The cytochrome P450 genesis locus: the origin and evolution of animal cytochrome P450s. Phil. Trans. R. Soc. B. 2013. No.368. P.20120474.
[10] A.N. Grechkin. Hydroperoxide lyase and divinyl ether synthase, Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2002. No.68-69. P.457-470.
[11] T. Senger, T. Wichard, S. Kunze, C. Gцbel, J. Lerchl, G. Pohnert, I. Feussner. A multifunctional lipoxygenase with fatty acid hydroperoxide cleaving activity from the moss Physcomitrella patens. J. Biol. Chem. 2005. No.280. P.7588-7596
[12] M. Stumpe, J. Bode, C. Gцbel, T. Wichard, A. Schaaf, W. Frank, M. Frank, R. Reski, G. Pohnert, I. Feussner. Biosynthesis of C9-aldehydes in the moss Physcomitrella patens. Biochim. Biophys. Acta. 2006. No.1761. P.301-312.
[13] P.K.G.S.S. Bandara, K. Takahashi, M. Sato, H. Matsuura, K. Nabeta. Cloning and functional analysis of an allene oxide synthase in Physcomitrella patens. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2009. No.73. P.2356-2359.
[14] M. Stumpe, C. Gцbel, B. Faltin, A.K. Beike, B. Hause, K. Himmelsbach, J. Bode, R. Kramell, C. Wasternack, W. Frank, R. Reski, I. Feussner. The moss Physcomitrella patens contains cyclopentenones but no jasmonates: mutations in allene oxide cyclase lead to reduced fertility and altered sporophyte morphology. New Phytol. 2010. No.188. P.740-749
[15] B. Schulze, R. Lauchli, M.M. Sonwa, A. Schmidt, W. Boland. Profiling of structurally labile oxylipins in plants by in situ derivatization with pentafluorobenzyl hydroxylamine. Anal Biochem. 2006. No.348. P.269-283.
[16] A.N. Grechkin, F.N. Fazliev, L.S. Mukhtarova. The lipoxygenase pathway in garlic (Allium sativum L.) bulbs: detection of the novel divinyl ether oxylipins. FEBS Lett. 1995. No.371. P.159-162.
[17] A.N. Grechkin, A.V. Ilyasov, M. Hamberg. On the mechanism of biosynthesis of divinyl ether oxylipins by enzyme from garlic bulbs. Eur. J. Biochem. 1997. No.245. P.137-142.
[18] M. Hamberg. A pathway for biosynthesis of divinyl ether fatty acids in green leaves. Lipids. 1998. No.33. P.1061-1071.
[19] I.R. Chechetkin, A. Blufard, M. Hamberg, A.N. Grechkin. A lipoxygenase-divinyl ether synthase pathway in flax (Linum usitatissimum L.) leaves. Phytochemistry. 2008. No.69. P.2008-2015.
[20] B.A. Vick, D.C. Zimmerman, D. Weisleder. Thermal alteration of a cyclic fatty acid produced by a flaxseed extract. 1979. No.14. P.734-740.
[21] H. Weber, B.A. Vick, E.E. Farmer. Dinor-oxo-phytodienoic acid: a new hexadecanoid signal in the jasmonate family. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1997. No.94. P.10473-10478.
[22] L.S. Mukhtarova, F.K. Mukhitova, Y.V. Gogolev, A.N. Grechkin. Hydroperoxide lyase cascade in pea seedlings: Non-volatile oxylipins and their age and stress dependent alterations. Phytochemistry. 2011. No.72. P. 356-364.
[23] T. Ichikawa, K. Yamada, M. Namikawa, K. Sakai, K. Kondo. New cyclopentenonyl fatty acids from Japanese mosses. J. Hattori Bot. Lab. 1984. No.56. P.209-213.
[24] T. Ichikawa, M. Namikawa, K. Yamada, K. Sakai, K. Kondo. Novel cyclopentenonyl fatty acids from mosses, Dicranum scoparium and Dicranum japonicum. Tetrahedron Lett. 1983. No.24. P.3337-3340.
[25] R. Kramell, O. Miersch, R. Atzorn. Parthier, B., Wasternack, C., Octadecanoid-derived alteration of gene expression and the «oxylipin signature» in stressed barley leaves. Implications for different signaling pathways. Plant Physiol. 2000. No.123. P.177-188.
[26] J. Scholz, F. Brodhun, E. Hornung, C. Herrfurth, M. Stumpe, A.K. Beike, B. Faltin, W. Frank, R. Reski, I. Feussner. Biosynthesis of allene oxides in Physcomitrella patens. BMC Plant Biol. 2012. P.12:228.
[27] T. Hashimoto, K. Takahashi, M. Sato, P.K.G.S.S. Bandara, K. Nabeta. Cloning and characterization of an allene oxide cyclase, PpAOC3, in Physcomitrella patens. Plant Growth Regul. 2011. No.65. P.239-245.