водов, белков, липидов путем субстратного фосфорилирования до пирувата (пировиноградной кислоты). При этом выделяется небольшое количество энергии. Акцептором водорода или электронов у анаэробов может быть сульфат. Если донорами и акцепторами водорода являются органические соединения, то такой процесс называется брожением. По конечному продукту расщепления углеводов различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое, муравьинокислое, маслянокислое и пропионовокислое брожение. Наличие свободного кислорода для строгих анаэробов является губительным, так как у них нет ферментов (каталаз), способных расщеплять Н2О2; понижен окислительно-восстановительный (редокс) потенциал; отсутствуют цитохромы.
3.Факультативные анаэробы могут расти и размножаться как в присутствии кислорода, так и без него (стафилококки, кишечная палочка). Они образуют АТФ при окислительном и субстратном фосфорилировании. Факультативные анаэробы могут осуществлять анаэробное дыхание, которое называется нитратным. Нитрат, являющийся акцептором водорода, восстанавливается до молекулярного азота и аммиака. Среди факультативных анаэробов различают аэротолерантные бактерии, которые растут при наличии молекулярного кислорода, но не используют его.
4.Микроаэрофилы растут при сниженном парциальном давлении кислорода. Различают микроаэрофильные аэробы (например, гонококки), которые лучше культи-
вируются при уменьшенном содержании О2 (около 5%), и микроаэрофильные анаэробы, которые способны расти в анаэробных и микроаэрофильных условиях, но не
культивируются в обычной воздушной среде или в СО2.
Выделяют также капнофильные микроорганизмы. Они представляют собой бактерии, растущие в присутствии повышенных концентраций углекислого газа (3-5%). К ним относятся бактероиды, фузобактерии, гемофильные бактерии и др.
Методы культивирования строгих анаэробов:
1) Посев уколом в высокий столбик сахарного агара, который сверху заливается слоем вазелинового масла.
2) Посев на среду Китта-Тароцци (МПБ, глюкоза, кусочки печени или мяса в качестве редуцирующих веществ, сверху среда залита слоем вазелинового масла).
3) Удаление воздуха из среды механическим путем. Используют анаэростаты, из которых выкачивается воздух.
4) Замена воздуха другим индифферентным газом, например азотом, аргоном, водородом.
5) Механическая защита от кислорода воздуха (метод Виньяль-Вейона). Берут стеклянную трубку, один конец которой вытягивают в капилляр, расплавляют агар, в него засевают культуру и затем насасывают агар в стерилизованную трубку, затем капилляр запаивают и трубку помещают в термостат. В среде вырастают колонии, которые можно извлечь, распилив трубку.
6) Химическое поглощение кислорода воздуха, например щелочным раствором пирогаллола.
7) Биологический метод – комбинированный посев культур анаэробов и аэробов. Посев производят на чашку с толстым слоем кровяного агара с глюкозой, разделенную пополам небольшой дорожкой, вырезанной посередине чашки прокаленным скальпелем. На одной половине чашки делают посев культуры аэробов, а на другой –
41
анаэробов. Края чашки смазывают парафином для герметизации и помещают в термостат. Сначала происходит рост аэробов, когда они исчерпывают из чашки кислород, начинается рост анаэробов.
3.8. Рост и размножение бактерий
Рост – увеличение размеров отдельной особи и упорядоченное воспроизведение всех химических компонентов и структур.
Размножение – процесс воспроизведения себе подобных особей, обеспечивающий продолжение существования вида.
Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты размножаются путем фрагментации нитевидных клеток, могут размножаться спорами.
Грамположительные бактерии делятся путем врастания внутрь клетки синтезирующихся перегородок деления, а грамотрицательные – путем перетяжки, в результате чего формируются гантелевидные фигуры, из которых образуются две одинаковых клетки. Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромосомы по полуконсервативному типу, приводящая к удвоению молекул ДНК нуклеоида.
Образовавшиеся в результате репликации две хромосомы расходятся, чему способствует увеличение размеров растущей клетки. По мере увеличения объема клетки прикрепленные к ЦПМ хромосомы удаляются друг от друга. Окончательное их обособление завершается образованием перетяжки или перегородки деления. Клетки с перегородкой деления расходятся в результате действия аутолитических ферментов, которые разрушают сердцевину перегородки деления.
Аутолиз может происходить неравномерно, и тогда делящиеся клетки в одном участке остаются связанными частью клеточной стенки в области перегородки деления. Такие клетки располагаются под углом друг к другу, что характерно для дифтерийных коринебактерий.
Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питательной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит к истощению среды и прекращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой системе называется периодическим культивированием, а культуру – периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивирование называется непрерывным, а культура – непрерывной. При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдаются: придонный рост, диффузное помутнение среды, образование пленки на поверхности среды.
Рост бактерий на жидкой среде подразделяют на несколько фаз или периодов.
І. Исходная стационарная фаза (1-2 часа) – время от момента посева до начала роста.
ІІ. Lag-фаза (запаздывание) – период между посевом бактерий и началом размножения. В лаг-фазе не увеличивается число клеток, но идет метаболизм, увеличивается количество белка, РНК, размеры, и остается неизменным количество ДНК. Идет
42
фенотипическая и генотипическая адаптация к среде, синтезируются индуцибельные ферменты. Продолжительность фазы 4-5 часов.
ІІІ. Log-фаза (фаза логарифмического роста). Характеризуется максимальной скоростью размножения бактерий для данной среды. Число клеток в культуре возрастает в геометрической прогрессии. Продолжительность 5-6 часов. Большинство видов бактерий делится каждые 20-30 мин, хотя существуют виды (микобактерии туберкулеза), которые делятся каждые 18 часов.
ІV. Фаза отрицательного ускорения – начинается замедление размножения из-за истощения питательной среды (около 2 ч).
V. Стационарная фаза максимума – когда количество погибших клеток равно количеству вновь появившихся. Она характеризуется М-концентрацией (концентрация микробных клеток в единице объема достигает максимума, длительность фазы составляет 2 ч).
VI. Фаза ускорения гибели (3 ч).
VII. Фаза логарифмической гибели, когда отмирание клеток происходит с постоянной скоростью (5 ч).
VII. Фаза уменьшения скорости отмирания –остающиеся в живых особи перехо-
дят в состояние покоя.
Продолжительность фаз гибели колеблется от десятка часов до нескольких недель.
Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотной питательной среде, образуют изолированные колонии, которые представляют собой видимые скопления особей одного вида микроорганизмов, образующихся из одной или нескольких клеток.
Колонии бывают выпуклыми, плоскими, куполообразными, вдавленными. Поверхность их – гладкой (S-формы) или шероховатой (R-формы), края – ровные или неровные. Форма колоний может быть различной: круглая, розеткообразная, звездчатая и др. По величине колонии подразделяют на крупные (4-5 мм в диаметре), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм) и карликовые (меньше 1 мм).
Колонии отличаются также по консистенции (сухие, слизистые, влажные), цвету, который зависит от наличия пигментов.
Характер роста на плотных и жидких питательных средах относят к культураль-
ным свойствам бактерий.
3.9. Питательные среды, их классификация
Питательные среды необходимы для получения чистой культуры микроорганизмов, изучения особенностей их морфологии и физиологии, для длительного сохранения микробов в лабораторных условиях.
Классификация питательных сред. По составу: а) естественные – это нату-
ральные продукты животного и растительного происхождения (молоко, яйца, сыворотка, кровь); б) искусственные – готовят по определенным рецептам из отваров животного происхождения с добавлением солей и пептона; в) синтетические – содержат
43
определенные химические соединения в точно указанных концентрациях (например, среда Сотона для возбудителя туберкулеза).
По консистенции: 1) жидкие – МПБ (мясо-пептонный бульон), пептонная вода; их используют для изучения биохимических свойств микробов, накопления биомассы; 2) полужидкие – обычно используют для сохранения культур микробов; 3) плотные – мясо-пептонный агар (МПА) – используют для выделения чистой культуры, получения отдельных колоний, определения количественного роста, антагонистических свойств бактерий, чувствительности к антибиотикам).
По назначению: 1) универсальные – МПА, МПБ; 2) специальные – использу-
ют для выращивания определенных видов микробов (сахарный бульон - для стрептококков, кровяной агар – для менингококков, среда Сабуро – для грибов); 3) элективные – используют для выделения определенных видов микробов, другие микробы или совсем не растут на таких средах, или их развитие сильно задерживается (щелочная пептонная вода с рН 9,0 для Vibrio choleraе); 4) дифференциально-диагностические
среды используют для изучения биохимических свойств микробов и отличия (дифференцировки) одного вида микроба от другого по характеру их ферментативной активности. Например, среда Эндо, в состав которой входят МПА, лактоза и фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Исходная среда имеет светло-розовый цвет. При разложении лактозы образуется ацетальдегид, который реагирует с сульфитом натрия, при этом колонии окрашиваются в ярко-красный цвет. Поэтому Е. coli, которая разлагает лактозу, при росте на среде Эндо образует красные колонии, а сальмонеллы и шигеллы – бесцветные, т.к. они лактозу не разлагают.
Требования, предъявляемые к питательным средам: стерильность; прозрачность; достаточное содержание основных органических и зольных элементов; наличие факторов роста (витамины, липиды); соответствующий рН (7,2-7,4); изотоничность (0,85% NaCl); определенный окислительновосстановительный потенциал и вязкость.
44
IV. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОВ
Начало истории вирусологии связано с именем Д.И. Ивановского, который в 1892 г. опубликовал работу по изучению мозаичной болезни табака. Он отметил, что возбудитель – мельчайшее существо, проходит через бактериальные фильтры, не растет на питательных средах, невидим в световом микроскопе.
В1898 г. Леффлер и Фрош открыли вирус ящура.
В1901 г. Рид и Кэррол выделили вирус из трупов людей, умерших от желтой лихорадки.
Д Эррель в 1910 г. обнаружил вирусы бактерий – бактериофаги.
Вирусы широко распространены в природе, окружающей среде и практически вездесущи. Они находятся в воздухе, воде, пище, космосе и в живых организмах, а вирусы бактерий – бактериофаги – в бактериях.
Медицинская вирусология изучает лишь вирусы, патогенные для человека или значимые для медицины (бактериофаги).
Основной задачей медицинской вирусологии является изучение морфологии, физиологии, генетики, экологии и эволюции вирусов и разработка методов диагностики, лечения и профилактики инфекций у человека.
Вирусы – это облигатные внутриклеточные паразиты, имеющие собственный геном, структурные белки и ферменты, способные репродуцироваться только в чувствительных к ним клетках животных, растений, бактериях. Это своеобразная форма жизни, биологически активные структуры, которые подчиняются законам эволюции, не имеют типичного клеточного строения, состоят из белков и одной нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), где закодирована вся генетическая информация вируса. Вирусы не обладают собственными метаболическими и энергетическими системами; их размножение происходит с использованием белоксинтезирующих и энергетических систем клетки хозяина, поэтому они являются облигатными внутриклеточными паразитами и размножаются в цитоплазме или в ядре клеток. Они используют рибосомы клетки хозяина для синтеза собственных белков. Имеют особый способ размножения
– дизъюнктивную (разобщенную) репродукцию: в клетке отдельно синтезируются нуклеиновые кислоты и белки вирусов, а затем происходит сборка их в вирусные частицы. Возможен второй путь – генетическая информация вируса интегрируется с геномом клетки и образуется провирус (например, у ретровирусов).
Вирусы имеют малые размеры (от 15 до 250 нм и более). Как и другие формы жизни вирусы обладают наследственностью и изменчивостью, многие вирусы сохраняют жизнеспособность при замораживании, высушивании, резистентны к антибиотикам, но чувствительны к высокой температуре.
Вирус вне клетки – вирион, имеет нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК) и белковую оболочку, способен кристаллизоваться, обладает инфекционностью, т.е. благодаря адресным белкам, белкам прикрепления, ферментам проникает в клетку, где его называют «вирус», интегрированный с ДНК хозяина вирус называется про-
вирус.
Кроме типичных вирусов известны необычные инфекционные частицы – прио-
ны и вироиды.
45
Прионы – белковые инфекционные частицы, которые имеют вид фибрилл размером 10-20х100-200 нм, массу 30 кД, не содержат нуклеиновой кислоты, устойчивы к нагреванию, к действию протеаз, ультрафиолетовых лучей, ультразвука и ионизирующей радиации. Прионы возникают как продукты мутации собственного гена или попадают в организм при употреблении мяса животных, содержащего прионы. Прионы накапливаются в пораженном органе, не вызывая цитопатогенного действия (ЦПД), иммунного ответа и воспалительных реакций. Они могут блокировать или активировать гены человека или животного.
Вироиды – это небольшие молекулы кольцевой суперспирализованной РНК, не содержащие белка, вызывающие заболевания у растений, возможно и у млекопитающих.
4.1.Классификация вирусов
Всилу своих особенностей вирусы выделены в отдельное надцарство Vira, в котором по типу нуклеиновой кислоты различают рибовирусы и дезоксирибовирусы
(табл. 1).
Подцарства делятся на семейства, которые подразделяются на подсемейства и роды. Вид – совокупность вирусов, имеющих почти идентичные геном (ДНК или РНК), свойства и способность вызывать определенный патологический процесс. Названия семейства имеют окончание viridae, подсемейство – virinae, рода – virus.
Признаки, используемые для классификации вирусов: 1) тип нуклеиновой кисло-
ты – ДНК или РНК; 2) их структура (однонитевая, двунитевая, линейная, кольцевая, фрагментированная, нефрагментированная с повторяющимися и инвертированными последовательностями); 3) структура, размеры, тип симметрии, число капсомеров; 4) наличие или отсутствие внешней оболочки (суперкапсида); 5) антигенная структура;
6)феномены генетических взаимодействий; 7) круг восприимчивых хозяев; 8) географическое распространение; 9) внутриядерная или цитоплазматическая локализация;
10)чувствительность к эфиру и детергентам; 11) путь передачи инфекции.
Для определения принадлежности к семейству ретровирусов обязательно учитывается наличие фермента обратной транскриптазы.
Вирусы, вызывающие инфекционные процессы у человека, входят в состав как ДНК-содержащих, так и РНК-содержащих вирусных семейств (см. табл. 1).
Таблица 1.
Классификация и некоторые свойства вирусов
Семейство |
Тип |
Размер |
Наличие |
Типовые |
вирусов |
нуклеиновой |
вирио- |
супер- |
представители |
кислоты |
на, нм |
капсида |
||
РНК-геномные вирусы
46