Он основан на оценке степени сходства и различия организмов по максимально возможному количеству фенотипических свойств и проявлений. Иногда проводят оценку более 100 показателей. Для увеличения достоверности определения признакам присваиваются коэффициенты (их еще называют весом). Чем более важен данный признак для определения возбудителя, чем реже он встречается у других микроорганизмов, тем выше вес признака и тем специфичнее он определяет данного возбудителя (например, продукция плазмокоагулазы у золотистого стафилококка).
2. Генетический подход.
Он основан на сходстве в строении ДНК геномов изучаемых бактерий. Считается, что микроорганизмы, принадлежащие к 1 виду, обладают от 70 до
100% гомологией ДНК. При 60% совпадении речь может идти о принадлежности бактерий к 1 роду.
Для генетической классификации используют метод гибридизации нуклеиновых кислот, изучают процентное содержание гуанина и цитозина в ДНК генома, определяют молекулярный вес ДНК, наличие плазмид. В последнее время, особенно для внутривидовой дифференциации микроорганизмов, используют метод полимеразной цепной реакции.
3. Типирование по рибосомальной РНК (риботипирование).
Оказалось, что рибосомальная РНК бактерий содержит высококонсервативные последовательности, которые в процессе эволюции изменялись незначительно. Различия в структуре рибосомальной РНК позволяют дифференцировать крупные таксоны (порядки, классы, семейства) у бактерий.
Генетические механизмы, лежащие в основе изменчивости микроорганизмов, обеспечивают только относительную стабильность признаков, которые в пределах одного и того же вида могут варьировать. Отсюда сложилось понятие о вариантах (типах) микроорганизмов, отличающихся отдельными признаками от стандартных видов. Так, различают: морфологические (морфовары), биологические (биовары), ферментативные (ферментовары), различные по резистентности к антибиотикам (резистенсвары) и бактериофагам (фаговары) варианты бактерий. Наряду с этим отдельные виды могут включать варианты, различающиеся по антигенной структуре (серовары), экологическим нишам, в которых они обитают (эковары) и патогенности для определенных хозяев (патовары).
Штаммом называют культуру одного вида микроорганизмов, выделенную из различных источников (организма человека, животного, окружающей среды) или из одного и того же источника, но в разное время. Обычно штаммы обозначают прото-
кольными номерами или называют либо по источнику выделения (водный, кишечный), либо по местности, где он был выделен. Штаммы микробов одного вида могут быть совершенно идентичными или различаться по степени вирулентности, метаболической активности, чувствительности к антибиотикам и антисептикам, однако свойства отдельных штаммов не выходят за пределы данного вида микроорганизмов.
Согласно биноминальной номенклатуре каждый микроорганизм имеет название, состоящее из двух слов: первое слово означает род и пишется с прописной буквы, второе слово означает вид и пишется со строчной буквы, например Escherichia coli. Возможно сокращение рода до первой буквы, реже встречаются сокращения до
20
первых двух или трех букв. Достаточно часто используют только родовое название, имея в виду все виды данного рода, или то, что идентификация проводилась только до рода. Вместо видового названия в этом случае используют сокращение: spp.
Клон – культура микроорганизмов, полученная из одной особи.
Чистая культура представляет собой микробные особи одного и того же вида, выращенные на питательной среде.
Особенности микроорганизмов определили набор признаков и свойств, которые используются в систематике и классификации:
1.Морфологические – величина, форма, взаимное расположение.
2.Тинкториальные – способность окрашиваться различными красителями при сложных методах окрашивания. Одним из наиболе важных признаков является отношение к окраске по Граму, которое зависит от структуры и химического строения клеточной стенки. По этому признаку все бактерии делятся на грамположительные и грамотрицательные.
3.Культуральные свойства – особенности роста бактерий на жидких и плотных питательных средах.
4. Подвижность бактерий. Различают бактерии подвижные и неподвижные. Подвижные бактерии разделяются на ползающие и плавающие, у которых подвижность связана с наличием жгутиков.
5.Физиологические свойства – способы питания, дыхания.
6.Биохимические свойства – способность расщеплять белки, углеводы, жиры до конечных продуктов обмена.
7.Чувствительность к специфическим бактериофагам.
8.Антигенные свойства (выявляют в иммунологических реакциях).
9.Липидный, белковый и углеводный состав. Белковые спектры определяют с помощью метода двумерного электрофореза в полиакриламидном геле, где разделяют смеси рибосомных, мембранных и внутриклеточных белков, получая белковые спектры соответствующей фракции определенного вида бактерий. Изучение состава жирных кислот проводят с помощью газовой хроматографии.
10.Генетические свойства. Их изучают, используя методы геносистемати-
ки. Наиболее точным методом установления генетического родства является определение степени сходства ДНК.
Молекулярно-биологические признаки основываются на гомологии эталонной и исследуемой ДНК, о которой судят по процентному содержанию гуанин-цитозин (Г+Ц)-пар или по степени гибридизации этих молекул. Химическими методами после гидролиза ДНК и разделения свободных оснований можно узнать нуклеотидный состав. Наиболее часто используется определение точки плавления ДНК, при которой происходит ее денатурация в результате разрыва водородных связей, соединяющих две цепи. Разделение цепей сопровождается заметным увеличением оптической плотности при 260 нм. Если она достигает 90% и выше, говорят о близком генетическом родстве эталонной ДНК с выделенной из исследуемого микроба. Содержание Г+Ц в ДНК можно измерить также путем центрифугирования образца ДНК в градиенте хлорида цезия. ДНК. Наибольшее разнообразие в содержании Г+Ц наблюдается в группе прокариотов, у которых эта величина колеблется от 30 до 75%, но среднее содержание
21
Г+Ц у многих различных штаммов микроорганизмов одного вида очень близко или идентично. В то же время два организма с одинаковым средним нуклеотидным составом ДНК могут резко различаться в генетическом отношении.
Метод гибридизации нуклеиновых кислот позволяет точно оценить генетическую гомологию штаммов. При быстром охлаждении раствора ДНК, подвергнутой тепловой денатурации, ее одиночные цепи остаются разделенными. Однако при температуре на 10-300С ниже точки плавления происходит специфическая реассоциация («отжиг») комплементарных цепей с образованием двухцепочечных молекул. Может быть проведена аналогичная реассоциация между молекулами ДНК и РНК, реассоциация «ДНК-рибосомальная РНК» представляет таксономический интерес.
Обычно при гибридизации нуклеиновых кислот используют образцы ДНК с радиоактивной меткой. На этом признаке основан метод молекулярных зондов, применяемый с диагностическими целями. Меченый зонд вместе с исследуемым материалом наносится на мембранный фильтр, после этого определяется степень его гомологии с исследуемой ДНК. Данный метод дает возможность быстро определить наличие в исследуемом материале ДНК тех или других микроорганизмов и поставить микробиологический диагноз заболевания.
В таксономии микроорганизмов международное признание получил определитель бактерий, изданный Д. Берги (1923 г.), который впоследствии неоднократно переиздавался.
Определитель выделяет грамположительные и грамотрицательные бактерии; эубактерии, лишенные клеточной стенки (микоплазмы); архебактерии (метан- и сульфатредуцирующие архебактерии, галофильные и термофильные архебактерии и архебактерии, лишенные клеточной стенки).
Прокариоты включают царства Eubacteria и Archaebacteria. В них входят отде-
лы.
Отдел I. Gracilicutes, к нему относятся грамотрицательные бактерии. Отдел II. Firmicutes, к нему относятся грамположительные бактерии.
Отдел III. Tenericutes – организмы, не имеющие клеточной стенки (сюда относятся микоплазмы).
Отдел IV. Mendosicutes – бактерии, у которых в клеточной стенке нет пептидогликана.
Для удобства использования определителя описание отделов дается по группам. Патогенные для человека бактерии входят в достаточно небольшое число групп. Группа 1. Спирохеты. Включает свободноживущие и паразитические виды; для
человека патогенными являются представители родов Treponema, Borrelia и Leptospira.
Группа 2. Аэробные и микроаэрофильные подвижные извитые и изогнутые грам(-) бактерии. Патогенные для человека виды входят в роды Campylobacter, Helicobacter и Spirillum.
Группа 3. Неподвижные (редко подвижные) грамотрицательные бактерии (не содержит патогенные виды).
Группа 4. Грамотрицательные аэробные и микроаэрофильные палочки и кокки. Патогенные для человека виды включены в состав семейств Legionellaceae,
22
Neisseriaceae и Pseudomonadaceae; в группу входят также патогенные и условно-
патогенные бактерии родов Acinetobacter, Afipia, Alcaligenes, Bordetella, Brucella, Flavobacterium, Francisella, Kingella, Moraxella.
Группа 5. Факультативно анаэробные грамотрицательные палочки. Образована тремя семействами – Enterobacteriaceae, Vibrionaceae и Pasteurellaceae, каждое из ко-
торых включает патогенные виды, а также патогенные и условно-патогенные бакте-
рии родов Calymmobacterium, Cardiobacterium, Eikenella, Gardnerella и Streptobacillus
Группа 6. Грамотрицательные анаэробные прямые, изогнутые и спиральные бактерии. Патогенные и условно-патогенные виды входят в состав родов Bacteroides, Fusobacterium, Porphyromonas и Prevotella.
Группа 7. Бактерии, осуществляющие диссимиляционное восстановление сульфата или серы. Не включает патогенные виды.
Группа 8. Анаэробные грамотрицательные кокки. Включает условно-патогенные бактерии рода Veillonella.
Группа 9. Риккетсии и хламидии. Три семейства – Rickettsiaceae, Bartonellaceae и Chlamydiaceae, каждое из которых содержит патогенные для человека виды.
Группы 10 и 11. Включают анокси- и оксигенные фототрофные бактерии, непатогенные для человека.
Группа 12. Аэробные хемолитотрофные бактерии и родственные организмы. Объединяет серо-, железо- и марганецокисляющие и нитрифицирующие бактерии (не вызывают поражений у человека).
Группы 13 и 14. Включают почкующиеся и/или бактерии с выростами и бактерии, обладающие чехлом. Представлены свободноживущими видами, непатогенными для человека.
Группы 15 и 16 Объединяют скользящие бактерии, не образующие плодовых тел, и скользящие бактерии, образующие плодовые тела (непатогенны для человека).
Группа 17. Грамположительные кокки. Включает условно-патогенные виды ро-
дов Enterococcus, Leuconostoc, Peptococcus, Peptostreptococcus, Sarcina,
Staphylococcus, Stomatococсus и Streptococcus.
Группа 18. Спорообразующие грамположительные палочки и кокки. Включает патогенные и условно-патогенные палочки родов Clostridium и Bacillus.
Группа 19. Неспорообразующие грамположительные палочки правильной формы. Включает условно-патогенные виды родов Erysipelothrix и Listeria.
Группа 20. Неспорообразующие грамположительные палочки неправильной формы. В состав группы входят патогенные и условно-патогенные виды родов
Actinomyces, Corynebacterium, Gardnerella, Mobiluncus и др.
Группа 21. Микобактерии. Включает единственный род Mycobacterium, объединяющий патогенные и условно-патогенные виды.
Группы 22-29. Актиномицеты. Среди многочисленных видов лишь нокар-
диоформные актиномицеты (группа 22) родов Gordona, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Jonesia, Oerskovia и Terrabacter способны вызывать поражения у чело-
века.
Группа 30. Микоплазмы. Патогенны для человека виды, включенные в состав родов Acholeplasma, Mycoplasma и Ureaplasma.
23
Не содержат патогенных для человека видов – метаногенные бактерии (груп-
па 31), сульфатредуцирующие бактерии (32), экстремально галофильные аэробные археобактерии (33), археобактерии, лишенные клеточной стенки (34), и экстремальные термофилы и гипертермофилы, метаболизирующие серу (35 группа).
2.2. Структура бактериальной клетки и химический состав микроорганизмов
Бактерии I и II отделов – это простейшие одноклеточные организмы, не имеют хлорофилла. Содержат нуклеиновую кислоту, белки, полисахариды, липиды, минеральные вещества, воду, микроэлементы. У них всегда присутствуют оболочка, цито-
плазма и нуклеоид. Не у всех бактерий имеются капсула, жгутики, фибриллы, пили, споры, включения.
Все эти структуры выявлены различными методами. Их величину определяют ультрацентрифугированием, ультрафильтрацией, микроскопией с использованием микрометра. Она колеблется от 0,1 нм до 10-20 нм (1000 нм=1 мкм; 1000 мкм=1 мм).
Оболочка бактерий состоит из трех слоев: слизистого (поверхностного), собственно клеточной стенки и ЦПМ – цитоплазматической мембраны.
Слизистый слой располагается поверх клеточной стенки, состоит из высокополимерных мукополисахаридов, которые не имеют с клеточной стенкой постоянной и прочной связи.
Клеточная стенка бактерий и грибов располагается между цитоплазматической мембраной и капсулой (если она имеется) или ионизированным слоем внешней среды
(рис. 1 и 2).
Толщина клеточной стенки колеблется от 10 до 35 нм. Клеточная стенка составляет 10-50% сухой массы бактерий, построена из полимеров или блоков, включающих липопротеиды, липополисахариды, протеины, тейхоевые кислоты.
Главным и специфичным для клеточной стенки компонентом является муреин или пептидогликан. Он имеется только у эубактерий (кроме микоплазм). Пептидогликан включает в себя остов и два набора пептидных цепочек – боковых и поперечных. Остов состоит из остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, связанных между собой -гликозидными связями. Основу пептидов связи составляют тетрапептиды, состоящие из чередующихся L- и D-аминокислот, например, L-аланин- D-глютаминовая кислотамезодиаминопимелиновая кислота-D-аланин.
В тетрапептидной боковой цепочке у большинства грамотрицательных бактерий имеется диаминопимелиновая кислота – уникальный компонент клеточной стенки, который имеется только у прокариотов.
У грамотрицательных бактерий клеточная стенка слоиста. Внутренний слой построен из пептидогликана (5-10%), не содержит тейхоевых кислот. Наружная мембрана имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с цитоплазматической мембраной. Основной компонент этих мембран – двойной слой липидов. Наружная мембрана представлена липополисахаридами, фосфолипидами и белками. В состав белков, заключенных в фосфолипидную матрицу, входят 3 или 4 основных («мажорных»), которые составляют 70% суммарных белков наружной мембраны; два из ос-
24