Кроме вышеперечисленных реакций ДНК в клетке имеет место дис­танционное действие на ДНК радиотоксинов – стабильных продуктов радио­лиза клеточных и межклеточных молекул, а также происходят различные процессы, вызывающие вторичные (опосредованное) повреждения ядерных структур и молекулы ДНК. Установлено, что гидратированные электроны взаимодействуют с гистонами, что приводит к нарушению связей и структуры самих гистонов, к нарушению связей гистонов с ДНК и к изменению структуры хроматина. В ядре образуются органические гидроперекиси, которые входят в состав радиотоксинов. Взаимодействие радикала ОН с фенолами и полифенолами в присутствии кислорода приводит к образованию ортохинонов и оксиортохенонов. Эти вещества являются мутагенами, ядами и ингибиторами, под действием которых изменяются свойства оснований, нарушается активность генов, и формируются разрывы нитей ДНК. Совокупность всех изменений вызывает нарушения синтеза ДНК, РНК и белка, поэтому нарушается деление клеток. Синтез ДНК очень радиочувствительная реакция. В зависимости от величины дозы он замедляется, нарушается или прекращается вообще. Синтез ДНК нарушается на следующих этапах:

1 – обменные реакции, приводящие к синтезу трифосфатов четырех нуклеотидов;

2 – начало синтеза ДНК, т.е. освобождение молекул ДНК от белков; раскручивание цепи и присоединение ДНК-полимеразы;

3 – синтез ДНК;

4 – радиационное угнетение синтеза ферментов, ответственных за синтез ДНК.

Косвенно на синтез ДНК оказывают влияние различные радиотоксины, которые всегда возникают в облученных клетках. Структурные повреждения ДНК (однонитиевые и двунитиевые разрывы) являются основной причиной гибели клеток при облучении.

Следует отметить, что реакции, связанные с потерями и модификациями оснований, так же как и разрывы фосфороэфирных и межуглеродных связей, неспецифичны для ионизирующего излучения, так как выход многих продук­тов этих реакций наблюдается при воздействии некоторых химических и физических факторов, клеточных ферментов типа эндо- и экзонуклеаз, ультра­фиолетового излучения.

РНК, представленная в клетке несколькими формами (матричная, рибо­сомальная, транспортная), относится к массовым молекулярным структурам клетки, т.е. формы повторяются, или содержатся в нескольких копиях, и, в отличие от ДНК, могут синтезироваться в требуемом количестве в клетке. Поэтому их радиационное повреждение менее значимо при лучевом по­ражении клетки. В основном типы радиационного повреждения молекул РНК такие же, как и молекулы ДНК.

Таким образом, при облучении клеток ионизирующим излучением происходит радиолиз микромолекул и макромолекул клеток, в результате которого изменяются свойства молекул, возникают первичные и вторичные радиотоксины, поэтому изменяются процессы обмена веществ в клетке, нарушается синтез ДНК, белков, что приводит в конечном итоге к гибели клеток.

Облучение клетки вызывает: 1) повреждение клеточной мембраны, что приводит к усилению притока и оттока различных веществ в клетку и из клетки; 2) изменение консистенции цитоплазмы (коагуляция, разжижение); 3) нарушение структурных компонентов цитоплаз­мы; 4) повреждение ядерной мембраны и ядерных компонентов; 5) нарушение синтеза различных веществ и процессов обмена веществ в клетке; 6) гибель клетки.

Для сравнения радиочувствительности разных клеток их облучают одинаковой дозой, а радиочувствительность оценивают по единому критерию (процент хромосомных аберраций, метотический индекс и выживаемость клеток). Для количественной оценки радиочувствительности клеток используют летальную дозу (Л₁₀₀) – это доза, при которой погибает 100 % клеток и полулетальную дозу (ЛД₅₀) – это доза, при которой погибает 50 % клеток.

В клетке критическим местом радиационного поражения является ядро, которое более радиочувствительно, чем цитоплазма, так как в нем находятся жизненно важные структуры – хромосомы и ДНК. Основная часть информации клеток находится в ядерной ДНК в виде генетического кода. Многие критерии радиаци­онного поражения клетки (число хромосомных аберраций в первом митозе, митотическая активность, интенсивность синтеза ДНК) тесно связаны с функ­циями ядра. Ядро связано с цитоплазмой клетки через ядерную мембрану. Между ядром и цитоплазму постоянно происходит обмен веществ. При использовании в качестве критерия радиочувствительности способность клетки к делению установлено, что ядро в 100 раз радиочувствительнее, чем цитоплазма. Вывод был получен в результате следующих экспериментов:

10. Структурные и функциональные нарушения клеточной и ядерной мембраны.

При повреждении отдельных участков протопласта (под действием высокой и низкой температуры, кислот, спиртов и др. веществ, а также ионизирующих излучений) свойства полупроницаемости теряются, и мембрана становится проницаемой. Это связано с тем, что радиационно-химические реакции окисления липидов приводят к нарушению структуры клеточной мембраны, поэтому нарушается ионный баланс клетки из-за выравнивания концентрации калия и натрия, а также проницаемость мембраны, поэтому нарушается приток питательных веществ в клетку и отток из клетки продуктов метаболизма. При этом соли, сахара, пигменты клеточного сока и другие вещества выходят из клеток в межклеточное пространство или в окружающий раствор. По изменению концентрации этих растворов определяют степень повреждения мембран. Она, как правило, пропорциональна концентрации выделяемых веществ. Действие ионизирующих излучений также приводит к нарушению проницаемости протопласта.

В облученной клетке нарушаются функции многочисленных внутриклеточных мембран, что приводит к нарушению ионного баланса клетки. Поэтому нарушается пространственное разделение между клеточными структурами и расширяется контакт и возрастают реакции взаимодействия свободных радикалов друг с другом и другими молекулами. Через цитоплазму проходит система мембран ЭПС (эндоплазматическая сеть), на которой формируются многие ферментативные системы. Активность ферментов и их нормальная деятельность проявляется только на нормальной мембране. Облучение вызывает нарушение мембраны и нарушение активности ферментов, даже если сами ферменты не повреждены. Системой ЭПС связаны рибосомы, на которых происходят трансляция кода матричной РНК в аминокислотную последовательность, на основании которой формируется молекула белка. Повреждение мембран митохондрий приводит к выходу из них кальция, который активизирует работу ферментов протеаз, разрушающих белок. Кроме этого происходит нарушение реакции окислительного фосфорилирования, по причине нарушения последовательности расположения ферментов на поврежденной мембране митохондрий. Радиационное повреждение мембран вызывает активацию лизосом, что приводит к увеличению выхода свободных лизосомных ферментов, которые могут нарушать белковые молекулы и нуклеиновые кислоты (в норме лизосомы расщепляют пищевые вещества и инородные тела клеток). Ядерная мембрана регулирует обмен веществ между ядром и цитоплазмой, обладает высокой избирательной способностью и исчезает в митозе. Повышение проницаемости ядерной мембраны при облучении приводит к нарушению энергетики ядра; проникновению из цитоплазмы ферментов и радиотоксинов, которые ускоряют распад хроматина, нарушают работу лигаз и репараз, которые устраняют первичные нарушения в ДНК, вызванные облучением.

11. Репродуктивная гибель клеток. Критерии оценки.

Закономерным проявлением действия излучения на клетки является подавление способности клеток к делению. Потеря способности клеток к неограниченному размножению называется репродуктивной или митотической гибелью клеток.

Клетки, дающие стерильное потомство, считают погибшими. Погибшие клетки не всегда имеют признаки видимых повреждений. Они живут после облучения до начала первого деления, поэтому их гибель регистрируется в процессе первого пострадиационного митоза, значительно реже гибель клетки наблюдается во 2-м, 3-м и 4-м митозах. Живые клетки проходят 5 митозов и продолжают делиться до формирования колоний. В культуре тканей в облученных клетках выделяют следующие аномальные явления:

1. Многополюсные клетки в первом пострадиационном митозе (по причине повреждения центриолей).

2. Формирование гигантских клеток при слиянии двух сестринских клеток или двух соседних клеток. Эти клетки проходят 2-3 митоза и погибают.

Основной причиной репродуктивной гибели клеток являются структурные повреждения молекулы ДНК К критериям репродуктивной гибели относят, во-первых, выживаемость или способность клеток к размножению. Количественно гибель клеток оценивают по клоногенной активности клеток путем сравнения ее величины в двух вариантах опыта. В первом варианте определяют выживаемость у облученных клеток, а во втором – выживаемость у необлученных клеток. Оба варианта клеток высевают в чашки Петри на питательную среду и помещают на 7-14 дней в термостат до появления видимых колоний. Выживаемость клеток определяется как отношение числа колоний, выросших из облученных клеток, к числу колоний, выросших из необлученных клеток. Поэтому выживаемость измеряется не в целых числах, а в десятичных. Погибшие клетки не формируют колоний, не анализируются, поэтому этот критерий не дает информации о причинах гибели клеток. Для оценки репродуктивной гибели используют цитологический метод или мета-анафазный анализ, т.е. анализируются клетки, находящиеся в метафазе и анафазе. При метафазном анализе выявляют все типы хромосомных аберраций у клеток, находящихся в метафазе. При анафазном анализе выявляют только мосты или тяжи из хромосомного материала в области экватора и фрагменты хромосом. В качестве второго критерия радиочувствительности используют количество или процент хромосомных аберраций в мета - и анафазе и их роль в гибели клеток, потому что клетки теряют способность к делению в основном при формировании в области экватора тяжей из хромосомного материала. Количественный анализ репродуктивной гибели клеток проводят на основании анализа графика «доза-эффект» или графика зависимости выживаемости клеток от величины дозы.

12. Хромосомные аберрации и их роль в репродуктивной гибели клеток.

Основной причиной гибели клеток при облучении являются структурные повреждения молекулы ДНК, которые обнаруживаются цитологическими методами в виде хромосомных перестроек или аберраций хромосом. При облучении клеток с хромосомами происходит два основных процесса: 1. Разрыв хромосом и хроматид. Хроматиды образуются в анафазе при разделении хромосом центромеромерами. 2. Соединение их разорванных концов с образованием различных структур.

Выделяют структурные и количественные хромосомные аберрации. При структурных аберрациях количество хромосом не изменяется, а при количественных – уменьшаются или увеличиваются (полиплоидия, гаплоидия и анеуплоидия). Хромосомные аберрации разделяются на внутрихромосомные (делеции, инверсии, инсерции и дупликации) и межхромосомные (обмены участками или транслокации). В зависимости от времени возникновения в митотическом цикле клетки аберрации разделяются на хромосомные и хроматидные. Хромосомные аберрации возникают в G₁–периоде, а хроматидные в конце S–периода и в конце G₂–периода.

В репродуктивной гибели клеток основную роль играют такие хромо­сомные аберрации, как делеции (образование фрагментов хромосом) и транс­локации (меж­хромо­сомные обмены).

Делеции бывают концевые и внутренние. При концевых делециях образуются ацентрические фрагменты (т.е. кусочки хромосом без центро­меры) в результате повреждения одного или двух плечей хромосомы и кольце­вая хромосома, При внутренних делециях в результате двойного разрыва хромосомы выпа­дает её фрагмент. Оставшиеся части хромосомы соединяются и формируют укороченную хромосому. Фраг­менты хромосом остаются в цитоплазме и образуют микроядра в одной из дочерних кле­ток. В клетке одновременно может повреждаться не одна, а несколько хромосом. Образование фрагментов приводит к потере генетической информации клеток. Потеря фрагментов не всегда приводит к гибели клеток в первых митозах. Гибель происходит в более поздних митозах (после 5-го митоза). Фрагментация хромосом при облучении клеток является одной из основных хромосомных аберраций при хроническом облучении малыми дозами клеток растений, животных и человека, находящихся в зонах радиоактивного загрязнения.

Межхромосомные обмены могут быть симметричные (между гомо­логичными участками хромосом) и асимметричные (между негомологичными участками хромосом). Завершенные симметричные обмены не вызывают поте­рь генетического материала, не препятствуют делению клеток. В результате асимметричных обменов образуются: 1) дицентрические мосты, представляющие собой тяж (фрагмент) из хромосомного материала в об­ласти экватора между двумя дочерними клетками при де­лении материнской клетки; 2) кольцевые хромосомы; 3) микроядра из фрагментов. Мосты препятствуют нормальному расхождению хромосомного материала к полюсам клетки и делению клеток в анафазе, что приводит к гибели клетки. Завершенные асимметричные обмены, или реципрокные транслокации, являются источниками генетических нарушений, которые накапливаются в клетках и передаются из поколения в поколение, создавая “генетический груз” популяции и способствуя появлению мутаций.

При хроническом облучении растений, произрастающих в зоне отчуждения и отселения, типичными хромосомными аберрациями являются фрагментация хромосом, кольцевые хромосомы и рецепрокные транслокации. Хромосомные нарушения у растений в условиях хронического облучения представлены в приложении 1.

Структурные аберрации хроматидного типа возникают во время удвое­ния и после удвоения хромосом. Хроматидные аберрации могут захватывать одну хрома­тиду, обе хроматиды или часть её поперечного сечения. Для хрома­тидных аберраций характерны разнообразные межхроматидные обмены и бо­лее высокая степень незавершенности обменов.

13. Задержка деления клеток при облучении. Причины задержки.

Радиобиологические эффекты в клетке зависят от стадии жизненного цикла в момент облучения. Многие радиационные повреждения легко переносятся клеткой и быстро восстанавливаются. Такие клеточные реакции называются физиологическими, или коммулятивными эффектами облучения. Они происходят в ближайшие сроки после облучения. Универсальной реакцией клеток на облучение является временная задержка деления клеток или радиационное блокирование митоза. Главная особенность задержки митоза состоит в том, что это явление временное. Оно не связано с повреждением генетического материала клетки, т.е. с повреждением ДНК и хромосом. Длительность задержки деления зависит от многих факторов:

1. Доза облучения. При увеличении дозы облучения продолжительность задержки деления каждой клетки и всех клеток популяции увеличивается, а митотическая активность снижается.

2. Стадия клеточного цикла в момент облучения клетки. Продолжительность цикла в норме составляет 10-48 часов. Митоз длится 30-60 минут. Наиболее длительная задержка деления клеток наблюдается у клеток, находящихся в S-периоде и G₂ –периоде. Клетки с длительной задержкой погибают чаще и в большем количестве (т.к. сильные повреждения ДНК не всегда восстанавливаются), чем клетки с меньшей задержкой (когда ДНК быстрее и полнее восстанавливается и синтез ДНК идет без глубоких нарушений).

Восстановление митотической активности или способности к делению происходит волнообразно, потому что ткани состоят из асинхронной (разнородной) клеточной популяции, т.е. из клеток, находящихся в разных стадиях цикла. Волнообразный характер восстановления деления клеток наблюдается при облучении ионизирующим излучением всех клеток, поэтому эта реакция считается универсальной реакцией клеток на облучение. Существует пороговая доза, т.е. минимальная доза, ниже которой не происходит задержка митоза. Ее величина не одинакова для разных клеток.

Механизм задержки деления клеток при облучении ионизирующим излучением не установлен. Но существует несколько точек зрения: 1. Нарушение обмена веществ; 2. Нарушение клеточной и ядерной мембран; 3. Задержка синтеза ДНК; 4. Повреждение внутриклеточных структур, регулирующих деление; 5. Накопление веществ, задерживающих деление; 6. Повреждение веществ, стимулирующих митоз; 7. Защитно-приспособительная реакция клеток, подобная реакциям клеток на многие внешние факторы.

14. Условия облучения растений в эксперименте, в природе и при радиоактивном загрязнении среды обитания. Способы облучения растений в эксперименте.

К условиям облучения растений относят: 1) тип ионизирующего излучения; 2) дозу и мощность дозы облучения; 3) продолжительность облучения растения; 4) состояние облучаемого растения в момент облучения и фазу развития растения; 5) сочета ние облучения с другими факторами физической или химической природы (свет, температура, кислород и др.); 6) метод облучения, который выбирают для облучения всего растения или отдельных его частей и органов, и др.

В природе растения облучаются одновременно всеми видами излучений от естественных радионуклидов (K⁴⁰, C¹⁴, H³, Be⁷ и др.) и от искусственных радионуклидов (Cs-137, Sr-90 и др.). Внешнее облучение происходит за счет радионуклидов, находящихся в почве, в воздухе и на поверхности самих растений, а также за счет космического излучения. Внутреннее облучение происходит за счет радионуклидов, находящихся в структуре тканей растений, куда они попадают на протяжении всей их жизни через корни и вегетативные органы.

В эксперименте можно разнообразить условия облучения растений путем выбора источника и программ облучения.

Для облучения используют различные типы излучений, относящихся к некорпускулярному, или электромагнитному, излучению и корпускулярному излучению. В качестве электромагнитного излучения используют рентгеновское излучение и гамма-излучение. Рентгеновское излучение образуется при торможении быстрых электронов, получаемых в вакууме (электромагнитное излучение с энергией квантов 0,12–1237 кэВ), а гамма-излучение – при радиоактивном распаде и при реакции анигиляции. В последнее время применяется преимущественно гамма-излучение. В качестве источников гамма-излучения используют радиоактивные изотопы кобальт-60 и цезий-137. Энергия гамма-квантов кобальта-60 составляет 1,33 и 1,17 МэВ, период полураспада – 5,3 года. Энергия гамма-квантов цезия-137 составляет 0,66 МэВ, период полураспада – 30 лет. Гамма-излучение более высокой энергии получают при торможении электронов высокой энергии в ускорителях заряженных частиц. Для облучения растений гамма- и рентгеновским излучением используют точечные источники излучения, специальные установки, оранжереи, фитоклиматические камеры, оборудованные источниками излучения, а также специальные гамма-поля. При использовании точечного источника равные дозы получают растения, находящиеся по концентрическим окружностям вокруг источника. В фитокамерах для получения более однородного поля используют несколько слабых по мощности источников, которые размещают равномерно по всей камере. Гамма-поле представляет собой участок земли, окруженный высоким земляным валом или бетонной стеной, в центре которого в шахте находится источник излучения. Для облучения растений источник дистанционно выводится из шахты, фиксируется на нужной высоте. Растения, расположенные ближе к источнику, получают большую дозу облучения. В последнее время широко используется синхротронное излучение, которое представляет собой непрерывный спектр энергии в виде электромагнитных волн, электронов и ультрафиолетового излучения.