Материал: Дохова З.Л.. Использование генной технологии для характеристики разводимых пород крупного рогатого скота в предгорной зоне Северного Кавказа

4

основании общей схемы исследований, представленной на рисунке 1. Полученные данные по племенным быкам из КБР сравнивали с результатами исследований других племобъединений: ОАО "Тамбовплем"; ОАО «ГЦВ СЖ»; ОАО "Кировплем".

Материалом для исследований служили образцы семени быков трех пород ОАО «Кабардино-Балкарское» по воспроизводству и биотехнологиям, а также цельная кровь и молоко лактирующих коров из СХПК «Верхнемалкинский». Кровь брали из яремной вены вместе с ветеринарными специалистами хозяйства. Для получения сывороток, а также изготовления суспензий эритроцитов, кровь отбирали в пробирки с консервантом в соотношении 4:1. После взятия крови производили отделение сыворотки с последующим ее замораживанием в морозильной камере при –20оС до проведения исследований. Характеристику генофонда у коров бурой швицкой породы племрепродуктора «Верхнемалкинский» КБР проводили по 10 системам групп крови (Сороковой П.Ф., 1974).

Образцы молока отбирали во время контрольных доек. Консервацию молока проводили бромополом. Оптимальной дозой считалась 1 таблетка бромопола на 30 мл молока. При проведении эксперимента с целью изготовления адыгейского сыра с учетом генотипов по каппа-казеину были сформированы 4 группы коров по 15 животных в каждой:

«Верхнемалкинский» КБР. После изготовления сыра из молока животных с генотипами по каппа-казеину (κ-CNАА, κ-CNВВ, κ-CNАВ, κ-CNАА+ВВ+АВ),

проводили химический анализ на содержание % влаги, % сухого вещества, % жира в натуральном сыре, % жира в сухом веществе по схеме, предложенной Кугеневым В.В., Барабанщиковым Н.В. (1988). Определение физико-химического состава молока и оценку сыра проводили согласно ГОСТам, в лаборатории компании «Молочный продукт», расположенной в Кабардино-Балкарской Республике (г. Нальчик).

Спермобанк ОАО «Кабардино-Балкарское» по воспроизводству и биотехнологиям, исследовали по мутантным аллелям двух наследственных заболеваний: дефицита лейкоцитарной адгезии (BLAD) и комплекса

аномалий позвоночника (CVM), и трем аллелям каппа-казеина (κ-CNА, κ- CNВ, κ-CNЕ).

Выделение ДНК из крови и спермы, оценка его качества, а также генотипирование аллелей проводили по схеме, предложенный Kantanen J. (1999). Диагностику мутантного аллеля, вызывающего дефицит лейкоцитарной адгезии или BLAD, осуществляли по методике, изложенной в работах Shuster D.E. et al. (1992) и Tammen I. (1994).

Молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов

Ассоциации между генотипами и качеством молока и сыра

Рисунок 1. Общая схема исследований

6

Диагностика мутантного аллеля комплекса аномалий позвоночника (CVM) осуществлялась по методу, описанному Rusc A., Kaminski S. (2007). Определение пролактина (PRL) и гормона роста (GH) проводили соответственно по методикам Mitra A. et al. (1995) и Mohammadabadi M.R. et al. (2010).

Идентификацию вариантов белков крови по локусам гемоглобина (НВ), трансферрина (TF), альбумина (ALB), преальбумина (PRE) осуществляли методом вертикального электрофореза на полиакриламидном геле (Gahne B. et al., 1977; Амбросьева Е.Д., 2005) c некоторыми модификациями (Петров С.Н., 2008).

Изучали следующие популяционно-генетические параметры: частоты аллелей и генотипов исследуемых локусов. Проверку генетического равновесия в изучаемых локусах проводили по формуле: χ2 = Σ Pэмп - Ртеор)2 / Ртеор, где χ2 - критерий соответствия фактического ожидаемому распределению животных по данному генотипу; Рэмп - фактическое число особей данного генотипа в популяции; Ртеор - теоретически ожидаемое число особей данного генотипа. Теоретически ожидаемое число особей определяли по формуле Харди - Вайнберга для двухаллельных систем:N = Np2 + N2pq + Nq2; формуле Бернштейна для полиаллельных систем: N = Np2 + Nq2 + Nr2 + N2pq + N2pr + N2qr. Для характеристики уровня гомо- и гетерозиготности определяли следующие параметры: а). Коэффициент гомозиготности (Са) популяции по формуле Робертсона: Са = где Са - ожидаемая гомозиготность, рi - частоты аллелей в локусе; б). Уровень полиморфности - Na (показатель числа действующих эффективных аллелей) по формуле Робертсона: Na = 1/Ca, где Са - коэффициент гомозиготности; в). Тест гетерозиготности (Т.Г.) по формуле Робертсона: Т.Г. = - отношение числа фактических гетерозигот к числу фактических гомозигот,

- отношение числа теоретических гетерозигот к числу теоретических гомозигот; г). Степень гомозиготности по нескольким локусам (SH) по Гельдерману: SH= ( (Hi - H) /n), где Нi - частная гомозиготность i-го локуса, Н - средняя гомозиготность по n локусам. Часть цифровых материалов обрабатывали общепринятыми методами вариационной статистики с применением персонального компьютера: Microsoft Office Excel. 2003; STATISTICA for Windows. Version 7. 1999.

3.РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1.Характеристика семени быков ОАО «Кабардино-Балкарское»

по воспроизводству и биотехнологиям, по гену каппа-казеина с учетом породы и генеалогического корня. Влияние κ-CNB аллеля на содержание

белка в молоке показаны на многих породах, включая черно-пеструю и даже гибридов зебу х черно-пестрая. Поэтому отбор животных по κ-CNB аллелю интегрирован в селекционные программы молочного скота многих стран мира. В задачу исследований входило проведение оценки генетической структуры по локусу каппа-казеина у 26 племенных быков следующих пород: голштинская черно-пестрой масти, голштинская красно-пестрой

7

масти, бурая швицкая, красная степная, принадлежащих ОАО «Кабардино-Балкарское» по воспроизводству и биотехнологиям (таблица

1).

Как видно из таблицы 1, во всех породах наблюдается преобладание аллеля κ-CNА по каппа-казеину. Частота аллеля κ-CNВ колеблется от 0,0 до 0,3182, наиболее высокий результат наблюдается у красной степной и бурой швицкой пород: соответственно 0,286 и 0,318. Анализируя встречаемость κ- CNВ аллеля можно сказать, что все быки отличаются довольно низкой частотой встречаемости этого аллеля. Полученные материалы свидетельствуют об отборе быковоспроизводящих коров по величине удоя. Установлено, что при увеличении интенсивности отбора наблюдается снижение встречаемости аллельного κ-CNВ варианта. Этот аллельный вариант "вымывается" из генотипа животных, особенно при массовом использовании голштинской породы в качестве улучшающей по удою.

Таблица 1 - Полиморфизм гена каппа-казеина у племенных быков различных пород (n=26)

Примечание: Н – наблюдаемое число генотипов; О – ожидаемое число генотипов; * - нарушено генетическое равновесие

Результаты на особях голштинской породы черно-пестрой масти показывают также, что встречаемость аллеля κ-CNВ имеет незначительный размах изменчивости и находится на уровне низких величин, близких европейским данным - 0,10-0,22 (Strzalkowska N. et al., 2002).

У голштинской красно-пестрой масти κ-CNВ аллель вовсе отсутствовал. Нарушение генетического равновесия по каппа-казеину отмечали только у быков красной степной породы за счет дефицита гетерозиготных и гомозиготных генотипов (χ2 = 5,1; df = 1; P<0,05).

Исследованные быки не обладали κ-CNЕ аллелем, снижающим технологические свойства молока (Lunden A., Afforselles J., 2000).

8

Проведены сравнительные исследования по встречаемости генотипов аллельных вариантов каппа-казеина (κ-CNА и κ-CNВ) у быков различных пород крупного рогатого скота (таблица 2).

Таблица 2 - Сравнительная характеристика локуса каппа-казеина у племенных быков различных пород и регионов Российской Федерации

2- ОАО " Тамбовплем "; 3 - ОАО «ГЦВ СЖ »; 4 - ОАО " Кировплем";

*- нарушение генетического равновесия ( 2 = 5,1; df=1; P<0,05)

Что касается голштинской красно-пестрой масти, то полученные данные имели следующие показатели: κ-CNВ = 0,130-1,0; κ-CNВВ – 0,0-6%. Это характерные данные для пород, специализированных в молочном направлении продуктивности. Что касается красной степной породы этот аллельный вариант встречался с частотой в пределах CNB=0,125-0,360, а частота κ-CNВВ гомозигот составляла от 0 до 14,3%. По встречаемости κ-CNВ