Интригующую разновидность Т-эпитопных модификаций представляют вирусные мутанты-антагонисты. Сохраняя способность связываться с Т-клеточными рецепторами, они вместо активации вызывают частичную или полную анергию CTL. Ее отношение к вирусной персистенции становится реальным, если учесть, что такая анергия может быть длительной, а зараженные клетки способны экспрессировать на поверхности дикие и мутантные вирусные эпитопы. Последние, интерферируя с СТL, защищают не только свой, но и родительский (немутантный) вирус. Т-антагонизм (он обнаружен у вирусов гепатита В и иммунодефицита человека) не связан с физической блокадой Т-рецепторов, так как для его воспроизведения требуется ничтожная дозировка мутантных Т-эпитопов, которая явно недостаточна для экранирования антигенных рецепторов. Следует скорее думать о фармакологическом эффекте, т.е. о блокаде образования медиаторов, транслирующих сигналы с Т-рецепторов.
Ещё один механизм антииммунитетной вирусной стратегии - нейтрализация цитокинов и их рецепторов. К числу цитокинов относятся важнейшие регуляторы индукции и реализации иммунного ответа, большинство из которых продуцируется активированными макрофагами и Т-лимфоцитами. Отсюда вряд ли случайно, что некоторые вирусы (прежде всего ДНК-вирусы с крупным геномом) научились дискриминировать этот механизм, перехватывая цитокины структурными аналогами их рецепторов (вироцепторы) или экранируя цитокиновые рецепторы при помощи пептидов, сходных с их естественными лигандами - цитокинами (вирокины). Так, поксвирусы кодируют пептиды, гомологичные рецепторам для туморонекротического фактора, интерлейкина-1, гамма-интерферона, альфа-/бета-интерферонов. Они (вироцепторы) выделяются из инфицированных клеток и, связывая цитокины, опережают их эффекты в системе антивирусной защиты. Герпесвирусы кодируют структурные аналоги рецепторов хемокинов - мощных хемоаттрактантов для клеток-эффекторов воспаления и иммунитета. Хемокиновые вироцепторы экспрессируются на поверхности зараженных клеток и, отвлекая на себя часть хемокинов, снижают интенсивность антивирусной реакции. Аденовирусы синтезируют белки, интерферирующие с цитотоксической активностью туморонекротических факторов CТL, естественных киллеров и макрофагов. Фактор, сходный с интерлейкином-1, обнаружен у вируса Эпстайна--Барр; одна из его функций связана с ослаблением реакций в системе Т-клеточного иммунитета.
Резюмируя, можно сказать, что благодаря необыкновенно плотной коэволюции вирусов и их хозяев возникли удивительно изящные формы симбиотических взаимоотношений, которые прослеживаются на всех уровнях организации вирусной материи - от бактериофагов до вирусов высших животных. Персистенция сочетает в себе элементы пассивной и активной самозащиты. Они неодинаково используются разными вирусами, имеют различную адаптивную силу и неравноценные патогенетические последствия.
Активация персистентных вирусов
Вирусная латенция динамична. Равновесие между вирусом и клеткой, вирусом и организмом может сдвигаться в пользу хозяина или паразита, создавая для каждого из них более или менее серьезные проблемы. По этому поводу А. Львов (французский генетик и вирусолог русского происхождения) остроумно заметил, что взаимоотношения между умеренными (т.е. персистентными) фагами и бактериями подобны брачному союзу: он кажется прочным, но под давлением обстоятельств рушится, и бывшие друзья становятся врагами. Нечто подобное справедливо и для медицинских вирусов. Подвергаясь активации, они реализуют свою болезнетворность, внося существенный вклад в инфекционную патологию.
Причины активации латентных вирусов (так же, как корни самой персистенции) следует анализировать по двум направлениям - на уровне клеток и на уровне организма. И в том и другом случае могут быть виновны вирус или хозяин, но в основе всегда лежит ослабление контроля над вирусом. Это переводит латенцию на рельсы продуктивной инфекции или хотя бы дерепрессирует вирусные гены, продукты которых приносят прямой или опосредованный вред хозяину. Вирусы меняются в результате мутаций, генетических рекомбинаций, генотипического или фенотипического смешивания с вирусами-помощниками. Отсюда толчком к активации может быть воздействие физических и химических факторов, оксидантного стресса, суперинфекции. Например, температурозависимые мутанты оживают при повышении температуры, а риновирусы активируются при охлаждении. Для репликации вируса гепатита D требуется присутствие вируса гепатита В, некоторые из парвовирусов нуждаются в помощи аденовирусов или вирусов простого герпеса. Иногда латенцию удается нарушить при сокультивировании с чувствительными (пермиссивными) клетками.
Одним из общих условий для патогенетически значимой активации вирусов является ослабление резистентности хозяина. С наибольшей очевидностью это проявляется у больных с ятрогенной и ВИЧ-иммунодепрессией. Одной из серьезных проблем в таких случаях являются эндогенные рецидивы герпетических инфекций на фоне подавления Т-клеточного иммунитета. Впрочем, и нормально работающая иммунная система не только не гарантирует защиты от клинически значимой персистенции вирусов, но и участвует в реализации ее патогенетического потенциала. Это совершенно необходимо для вирусов, которые лишены собственной цитотоксичности, формально безвредны для изолированных клеток, но обретают болезнетворность, подключая эффекторы иммунитета.
Активация персистентных вирусов ведет к разнообразным клиническим последствиям, которые, как и при обычных инфекциях, отражают избирательную цитотропность и особенности взаимоотношений в системе «вирус-клетка». Памятуя об этом, их можно объединить в несколько групп (Рис. 12). Рецидивы острых поражений типичны для вирусов с прямой цитотоксичностью (вирусы простого герпеса, ветряной оспы, опоясывающего лишая, цитомегаловирус). Хроническое течение имеет обычно иммунопатогенетическую основу (например, гепатит В). Опасность внутриутробного инфицирования возникает при вирусемии беременных, предрасполагающей к трансплацентарной (вертикальной) передаче возбудителя (цитомегаловирус, вирус гепатита В, ВИЧ). Онкогенность обычно связана с интегративными инфекциями, когда вирусы, дестабилизируя клеточный геном, способствуют экспрессии его онкогенов (точнее - протоонкогенов).
Рис. 12. Патогенетически значимые последствия вирусной персистенции.
Особой категорией являются медленные нейроинфекции - подострые спонгиозные (губчатые) вирусные энцефалопатии. Они характеризуются длительным (несколько лет) инкубационным периодом и, прогрессируя без ремиссий, неизбежно ведут к смерти на фоне необратимой дегенерации нейронов. Возбудители некоторых из них совершенно уникальны: это инфекционные белки, лишенные генетического материала (ДНК или РНК). Именно поэтому они получили название прионов (сокращение двух слов -- протеин и инфекционный).
Но этиология медленных нейроинфекций не ограничивается прионами. Их причиной могут быть и обычные, канонические вирусы, персистирующие в ЦНС. Кстати, именно с них началось изучение этой удивительной патологии. Начало положил Б. Сигурдсон, доказавший инфекционную природу болезни висны-мэди овец, завезенных в Исландию из Германии для развития каракулеводства. Эти исследования начались в конце 1930-х гг., но лишь в 1954 г. Б. Сигурдсон сформулировал основные положения концепции о медленных инфекциях. Возбудителем висны-мэди (исл. «чахнущий» и «одышка») оказался ретравирус, чем поставил немало вопросов. Неожиданным, например, явилось то, что он отлично размножается в клеточных культурах, вызывая острый (т.е. быстрый) цитопатический эффект. Иными словами, отсроченное и медленное поражение ЦНС связано с особенностями поведения вируса в инфицированном организме, а не с его биологической уникальностью. Было установлено, что возбудитель бессимптомно персистирует в макрофагах, а его распространение сдерживается антителами. В вирусной популяции вызревают ускользающие мутанты, и не исключено, что именно они обеспечивают эволюцию процесса.
Человек не заражается вирусом висны-мэди, но у него есть свои медленные нейротропные вирусы. Прогрессирующая дегенерация нейронов головного мозга наблюдается при ВИЧ-инфекции, являясь одним из центральных проявлений синдрома приобретенного иммунодефицита. Вирус кори, персистируя в нейронах головного мозга, вызывает подострый склерозирующий энцефалит. Опасны паповавирусы (прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия), вирус краснухи (прогрессирующий панэнцефалит как последствие врожденной краснухи), цитомегаловирус (цитомегаловирусная инфекция мозга), вирус простого герпеса (подострый энцефалит), аденовирусы типов 7 и 32 (подострый энцефалит), вирус клещевого энцефалита и другие тогавирусы (эпилепсия Кожевникова и прогрессирующий бульбарный паралич). Продолжаются поиски этиологических агентов таких медленных заболеваний ЦНС, как рассеянный склероз, болезнь Паркинсона, шизофрения, болезнь Альцгеймера.
Просматривается и тенденция к расширению классической концепции о медленных инфекциях. По логике к ним могут быть отнесены не только дегенеративные изменения ЦНС, но и ряд других заболеваний, вирусная (или вирусоподобная) природа которых доказана или может быть установлена в будущем. Например, медленной инфекцией можно считать СПИД (это относится не только к ВИЧ-индуцированному поражению ЦНС), хронический гепатит В и С, ретровирусный Т-клеточный лейкоз. В опытах на животных обнаружено влияние вирусной персистенции на функции эндокринных желез (карликовость, диабет), подозревается участие вирусов в развитии атеросклероза и аутоиммунных заболеваний. Здесь кроме новых герпесвирусов большой интерес вызывают эндогенные ретровирусы, которые обнаружены в различных тканях, включая плаценту. Наиболее радикальные сторонники патогенетически значимой персистенции вирусов связывают с ней развитие опухолей и даже старение организма.
Практическое значение цитопатического действия для выявления вирусов в биологическом материале и объектах окружающей среды
Факт размножения вирусов в чувствительных клетках in vitro определяют по цитопатическим эффектам (в том числе бляшкообразованию, тельцам включений).
Цитопатические эффекты оценивают при микроскопии клеточных культур. По степени поражения клеток выделяют вирусы с высокой или умеренной цитопатогенностью. Размножение вирусов в культурах клеток сопровождается нарушениями морфологии клеток монослоя. Некоторые вирусы вызывают характерные цитопатические изменения, что (с учётом клинической картины заболевания) позволяет быстро поставить предварительный диагноз. Например, размножение парамиксовирусов (вирусы кори, паротита, PC-вирус) сопровождается появлением характерных гигантских многоядерных клеток; аденовирусы вызывают образование скоплений больших круглых клеток, а при репродукции герпесвирусов клетки округлой формы диффузно располагаются по всему монослою.
Бляшкообразование
«Бляшками» называют негативные колонии -- участки разрушенных клеток, выглядящие как зоны просветления на монослоях клеток, покрытых слоем агара. В некоторых случаях дозу и цитопатогенность вируса выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ).
Тельца включений
Многие вирусы вызывают появление в заражённых клетках характерных образований - скоплений вирусных белков или частиц, видимых в световой микроскоп. Тельца включений могут располагаться как в цитоплазме (тельца Гварниери при оспе), так и в ядрах клеток (аденовирусы).
Феномен гемадсорбции
Многие заражённые вирусами клетки приобретают способность сорбировать на своей поверхности различные эритроциты. Феномен гемадсорбции имеет общие механизмы с гемагглютинацией и проявляется на ранних сроках, до проявления цитопатического эффекта, при его отсутствии либо слабой выраженности.
Практическое значение цитопатического действия для испытания вирусных вакцин на присутствие посторонних агентов в соответствии с ОФС.1.7.2.0006.15
Для производства вирусных вакцин допускается использовать только субстраты, одобренные национальными регулирующими органами. Если для приготовления иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП) используются ткани животных или эмбрионы птиц, а также приготовленные на их основе клеточные культуры, то животные и эмбрионы должны поступать из изолированных, постоянно контролируемых хозяйств, свободных от специфической патогенной флоры (SPF), если в нормативной документации нет других указаний.
На присутствие посторонних агентов должны быть испытаны:
§ контрольные клеточные культуры (клетки, отобранные из производственного пула клеточных культур до внесения вакцинного штамма);
§ объединённый вирусный сбор вакцинного и посевного вирусов для живых и инактивированных вакцин;
§ объединённый вирусный сбор (полуфабрикат вакцины до добавления вспомогательных веществ) каждой серии живых вирусных вакцин.
Учитывая специфические особенности производства ИЛП, в нормативную документацию на них могут быть введены дополнительные требования.
Испытание контрольной клеточной культуры. Исследование в клеточных культурах
Испытанию подвергается не менее 500 мл незаражённой клеточной суспензии в концентрации, используемой для посева клеточных культур-продуцентов вакцины.
Отобранную в качестве контрольной клеточную суспензию разливают во флаконы, клетки оставляют незаражёнными и инкубируют в тех же условиях, что и клетки, используемые для производства вакцины. За контрольной клеточной культурой наблюдают до времени последнего сбора вирусов с культур-продуцентов вакцины, но не менее 14 сут. В конце периода наблюдения все флаконы с контрольными клеточными культурами исследуют с помощью светового микроскопа на наличие цитопатических изменений. Во время культивирования контрольных клеток не должно выявляться признаков специфической дегенерации.