Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации
ФАКУЛЬТЕТ ПРОМЫШЛЕННОЙ ТЕХНОЛОГИИ ЛЕКАРСТВ
Кафедра микробиологии
Реферат
на тему: Цитопатическое действие вирусов
Работу выполнила
Педченко Евгения Александровна
Санкт-Петербург 2018 г.
Цитопатическое действие вирусов
О размножении вирусов в культуре ткани можно судить по цитопатическому действию (ЦПД):
· деструкции клеток;
· изменению их морфологии;
· формированию многоядерных симпластов или синцития в результате слияния клеток;
· возможному образованию включений - структур, не свойственных нормальным клеткам.
Таким образом, цитопатическое действие вирусов - деструктивные изменения отдельных клеток и клеточного монослоя, возникающие в результате продуктивной вирусной инфекции клеток и цитотоксического действия вирионов.
Типы проявления цитопатического действия вирусов
Цитопатическое действие вирусов имеет четыре основных типа проявления:
· круглоклеточная дегенерация;
· образование многоядерных гигантских клеток (симпластов);
· развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоёв клеток;
· образование включений.
Круглоклеточная дегенерация
Круглоклеточная дегенерация - образование скоплений больших округлых клеток, которые напоминают гроздья, возникает вследствие утраты внеклеточных связей и округления клеток.
Рис.1. Круглоклеточная дегенерация, вызванная цитомигаловирусом
Симпласты
Симпласты представлены гигантскими многоядерными клетками (например, клетки Цапка, выявляемые при герпетических поражениях), образующимися в результате модификации ЦПМ лизосомальными ферментами. Реже наблюдают образование синцитиев - больших конгломератов цитоплазмы, содержащих сотни и тысячи ядер связанных между собой клеток. Образование синцитиев обусловлено модификацией ЦПМ поверхностными гликопротеинами и характерно для парамиксовирусов.
Образование симпласта (синцития)
Феноменология сводится к слиянию нескольких клеток с образованием поликариона - многоядерной нежизнеспособной клетки. Образование симпласта характерно для сложных (оболочечных) вирусов и обусловлено рецепторзависимой цитотропностью суперкапсидных белков. Симпласт образуется двумя способами -- внешним и внутренним (Рис. 2).
Рис.2. Внешний (а) и внутренний (б) механизмы вирусиндуцированного образования симпласта
Слияние снаружи описано для парамиксовирусов (возбудители кори, парагриппа, паротита, респираторно-синцитиальный вирус) и наблюдается при множественном заражении благодаря одновременному взаимодействию вируса (вириона) с несколькими клетками. Это вызывает их агрегацию, а затем слияние клеточных мембран. И то и другое не требует синтеза вирусных белков, проявляясь в первые часы после заражения клеточных культур.
Слияние изнутри - более универсальный процесс, известный для многих оболочечных вирусов. В этом случае образованию симпласта предшествует синтез и включение вирусных белков в клеточные мембраны. Такие белки рецептируются соседними клетками, индуцируя их агрегацию. Феномен возникает при низкой дозировке инфекта и выявляется на поздних этапах репликации.
Пролиферация
Под пролиферацией понимают процесс деления клеток, приводящий к увеличению объема ткани.
Наиболее часто пролиферация служит проявлением воспалительного процесса, повреждений, опухоли. Усиление пролиферации лежит в основе разрастания тканей в новообразованиях, при гиперпластических процессах. Предраковые изменения, в том числе дисплазия, также сопровождаются повышенной пролиферацией клеток.
Если при воспалительных изменениях или травматических повреждениях пролиферация носит обычно преходящий характер и призвана восстановить ткань до нормы, то в случае опухолей она приобретает иное значение. При новообразованиях пролиферация не только избыточна, но и безостановочна, клетки делятся непрерывно, приводя к появлению и росту опухоли. Предела такой пролиферации не существует, как нет предела и клеточному делению в опухоли.
Рис.3. Пролиферация (размножение) клеток
Пролиферация нередко сопровождается атипией, то есть размножающиеся клетки обретают несвойственные им черты, изменяются внешне и функционально. Атипия говорит о возможной предраковой трансформации. Появление у клеток нехарактерных черт при усиленной пролиферации неудивительно: быстрое размножение создает условия для генетических мутаций, а клетки не успевают как следует созреть. В этом случае количество не означает качество, и в стремительно размножающемся клоне клеток рано или поздно появляются аномальные, мутировавшие элементы.
Факт высокой вероятности атипии при клеточной пролиферации делает этот процесс потенциально опасным, поэтому врачи относятся к нему настороженно. Если клетки изменили свой вид или свойства, можно говорить о предраковом состоянии и нужно срочно принимать меры по ликвидации патологического очага.
Типы включений
Включения выявляются в окрашенных по Романовскому-Гимзе мазках из заражённых клеток. Они бывают эозинофильные и базофильные.
Рис.4. Выявление включений при помощи окрашивания по Романовскому-Гимзе
По локализации в клетке включения различают на цитоплазматические, ядерные и смешанные.
Характерные ядерные включения формируются в клетках, заражённых вирусами герпеса (тельца Каудри), цитомегалии и полиомы, аденовирусами, а цитоплазматические включения - вирусами оспы (тельца Гварниери и Пашена), бешенства (тельца Бабеша-Негри) и другими.
По форме, размерам, структуре, отношению к красителям вирусные включения строго специфичны. Например, тельца Гварниери имеют округлую, серповидную или амебоидную форму диаметром 1-10 мкм, тельца Бабеша-Негри - овальные или эллипсоидные, достигающие 20 мкм, включения реовирусов серповидные, наполовину охватывающие клеточное ядро, коревые включения - в виде почкующихся мелких дрожжей.
Рис.5. Тельца Каудри
Рис.6. Тельца Гварниери
Рис.7. Тельца Пашена
Рис.8. Тельца Бабеша-Негри
Выявление вирусного заражения культуры ткани
О размножении вирусов в культуре ткани также можно судить по методу "бляшек" (негативных колоний). При культивировании вирусов в клеточном монослое под агаровым покрытием на месте поражённых клеток образуются зоны деструкции моносом, так называемые "стерильные пятна" или бляшки. Это даёт возможность не только определить число вирионов в 1 мл среды (считается, что одна бляшка является потомство одного вириона), но и дифференцировать вирусы между собой по феномену бляшкообразрования.
Следующим методом, позволяющим судить о размножении вирусов (только гемагглютинирующих) в культуре ткани, можно считать реакцию гемадсорбции. При культивировании вирусов, обладающих гемагглютинирующей активностью, может происходить избыточный синтез гемагглютининов. Эти молекулы экспрессируются на поверхности клеток культуры ткани, и клетки культуры ткани приобретают способность адсорбировать на себе эритроциты - феномен гемадсорбции. Молекулы гемагглютинина накапливаются и в среде культивирования, это приводит к тому, что культуральная жидкость (в ней накапливаются новые вирионы) приобретёт способность вызывать гемагглютинацию.
Наиболее распространённым методом оценки размножения вирусов в культуре ткани является метод "цветной пробы". При размножении в питательной среде с индикатором незаражённых клеток культуры ткани вследствие образования кислых продуктов метаболизма она изменяет свой цвет. При репродукции вируса нормальный метаболизм клеток нарушается, кислые продукты не образуются, среда сохраняет исходный цвет.
Внешние проявления и механизмы цитопатического эффекта
В его основе лежит повышение проницаемости плазматической мембраны. Открывая доступ Са2+, это ведёт к внутриклеточному ионному дисбалансу, пассивному вхождению воды, разбуханию клетки, разрыву мембраны и вытеканию цитоплазмы. В клеточных культурах этому соответствуют зоны так называемых негативных колоний - бляшек (рис. 9). Гибели клеток предшествует появление цитоплазматических или ядерных включений, которые возникают в местах сборки вирусных нуклеокапсидов и иногда заметны под микроскопом (рис. 10).
Рис. 9. Цитопатическое действие вируса полиомиелита: бляшки (колонии) в культуре клеток почки обезьяны: а -- незараженный монослой клеток; б -- вирус в разведении 10-4; в -- вирус в разведении 10-5
Рис. 10. Кристаллоподобные скопления вирионов аденовируса в ядре инфицированной клетки
Формально цитолиз можно представить как взрыв изнутри, когда плазматическая мембрана лопается под напором вирусных частиц, скапливающихся в клетке. Высвобождение оболочечных (сложных) вирусов происходит путём почкования. В этом случае вирусный нуклеокапсид покрывается наружной оболочкой (суперкапсидом), отбирая у клетки фрагмент модифицированной мембраны. Здесь возможен феномен решета: при множественном почковании клетка не успевает ликвидировать «дыры» в мембране и предупредить вытекание цитоплазмы. Допускается и вероятность аутолиза в связи с повреждением лизосом и высвобождением из них деструктивных ферментов.
Но всё это выглядит слишком прямолинейно. Клетке отдаётся роль пассивного полигона, где вирус беспрепятственно воспроизводит своё потомство, не встречая сопротивления. События, которые предшествуют и, возможно, способствуют цитолизу, остаются за кадром. Между тем, количество зрелых вирионов, накапливающихся в клетках, не всегда коррелирует с литическим эффектом. Известны примеры, когда клетка гибнет, не дождавшись гиперпродукции вируса. Это означает, что должны быть иные (возможно, главные) причины цитолиза, связанные с более тонким вмешательством вируса в жизнь клетки.
Вирусная инфекция - яркий пример молекулярной патологии, которая формируется под влиянием конкурентного вмешательства вирусных белков в жизненно важные процессы клетки. Жить - значит непрерывно обновлять свои функциональные и структурные элементы. Клетка, лишённая такой возможности, погибает.
Отсюда наиболее общим условием цитопатического эффекта следует считать подавление обновляющего синтеза макромолекул, стабилизирующих клеточный гомеостаз. Вирусологи называют это дискриминацией, подразумевая, что вирус вынуждает клетку переключиться на синтез своих нуклеиновых кислот и белков; самообновление клетки прекращается или задерживается. За этим скрывается множество механизмов, большинство из которых не раскрыты, хотя ряд примеров убеждает в их удивительной изящности. Так, вирус полиомиелита блокирует белок, необходимый для взаимодействия клеточных мРНК с рибосомами (кэп-связывающий белок); полиовирусная мРНК не нуждается в этой реакции, получая возможность для селективной трансляции. Действие вируса бешенства на нейроны определяется поверхностным гликопротеином G. Секвенирование (анализ нуклеотидной последовательности) клонированного гена G двух аттенуированных авирулентных штаммов показало, что лишение вируса нейротропности связано с заменой единственной аминокислоты в одном из участков гликопротеина G. Не ясно, чем обусловлен механизм аттенуации (нарушением связывания вируса нейронами или особенностями вирусной репликации), но это говорит о высокой специфичности факторов, вовлекаемых во взаимодействие вируса и клетки. Одной из универсальных мишеней для вирусов являются клеточные тирозин-протеинкиназы. Благодаря сопряжению с ключевыми звеньями метаболизма их экранирование вирусными белками не только подавляет важнейшие функции клеток, но и возбуждает реакции, обслуживающие вирусную репликацию.
Апоптоз
В отличие от цитолиза, который всегда пассивен, возникая при грубых повреждениях плазматической мембраны, апоптоз является активным, генетически запрограммированным отмиранием клеток. Есть факты, позволяющие думать, что изменение соотношений между ростовыми и апоптозными потенциями клеток влияет на цитопатический эффект вирусов. Гиперэкспрессия апоптозных генов усиливает гибель, тогда как блокада апоптозной программы стимулирует рост и размножение, вызывая гиперпролиферацию (онкогенную трансформацию) клеток.
Известно более десятка вирусных генов, которые кодируют факторы, усиливающие апоптозный процесс. Обнаружены они и у вирусов человека (аденовирусы, герпесвирусы, папилломавирусы, вирусы гриппа, ВИЧ-вирусы, вирус гепатита В и др.). В ряде случаев апоптоз коррелирует с усилением экспрессии р53 - гена, претендующего на одну из ключевых позиций в индукции апоптоза. Гибель клеток удается предотвратить при помощи продукта протоонкогена bcl-2, усиливающего клеточную пролиферацию.
Предложена гипотеза, согласно которой гибель CD4 Т-лимфоцитов при ВИЧ-инфекции связана с апоптозом. Пусковым фактором служит взаимодействие вирусного суперкапсидного гликопротеина gp120 с CD4-рецепторами лимфоцитов - сигнал, запускающий апоптозный механизм подобно рецепторзависимому апоптозу в системах Fas-FasL и ТНФ-ТНФR. Пока это единственный пример такого рода; в остальных случаях для индукции апоптоза требуется проникновение вируса в клетку и хотя бы частичная экспрессия его генома.
Опережающая смерть клетки, несущей зачаток вируса - исход, выгодный скорее хозяину, чем вирусу. Неслучайно об этом говорят как об альтруистическом самоубийстве, подразумевая, что клетка предпочитает погибнуть, исключив возможность размножения потенциально опасного вируса. Логика подсказывает, что вирусы должны обладать и альтернативным механизмом, который, продлевая жизнь клеток, создавал бы условия для воссоздания как можно более многочисленного вирусного потомства в литическом цикле или обеспечивал переход вируса в латентное состояние (персистенцию). Действительно, некоторые вирусы способны блокировать апоптозный ответ на собственную инфекцию. Это достигается разными способами, но их принцип сводится к двум механизмам - повышение экспрессии антиапоптозных (ростстимулирующих) генов клетки и инактивация эффекторных молекул апоптоза. К первой группе можно отнести стимуляцию протоонкогенов типа bcl-2 (это, в частности, наблюдается при персистенции вируса Эпстайна--Барр в В-лимфоцитах), ко второй - блокаду Р53, продукта апоптозного гена р53 (Е6 протеин вируса папилломы человека).