Статья: Биотехнология оздоровления и сохранения аборигенных донских сортов винограда

Биотехнология оздоровления и сохранения аборигенных донских сортов винограда

Дорошенко Наталья Петровна

Ребров Антон Николаевич

Трошин Леонид Петрович

Аннотации

В статье приведены результаты микроклонального размножения и оздоровления аборигенных сортов винограда, создания базисных маточников. Дополнительно к культуре апикальных меристем разработана хемотерапия с применением салициловой кислоты. Разработан способ деконтаминации растений от микоплазменной инфекции, который включает введение в питательную среду антибиотика Цефотаксим в концентрации от 50 до 450 мг/л в зависимости от степени инфицирования маточных растений. Добавление в состав питательной среды препарата Эмистим снижает гибель меристем от инфекции в 3-5 раз, улучшает их дифференциацию. Применение препарата Мелафен способствует улучшению морфогенеза и качественных характеристик растений. Отмечена высокая приживаемость мериклонов во время адаптации к нестерильным условиям. Биологическое тестирование на травянистых индикаторах показало отсутствие хронических заболеваний. Растения после адаптации к нестерильным условиям высажены, в виде вегетирующих саженцев с закрытой корневой системой, на базисном маточнике. Приживаемость растений составила 70-80%, у некоторых сортов она выше: 96,4% (Сыпун черный) - 98,6 % (Крестовский). Доказано, что при клональном микроразмножении растений in vitro не происходит изменений на генетическом уровне даже через 8 лет культивирования, что подтверждает надежность разработанной технологии размножения и оздоровления аборигенных сортов винограда in vitro

Ключевые слова: АБОРИГЕННЫЕ ДОНСКИЕ СОРТА ВИНОГРАДА, IN VITRO, ХЕМОТЕРАПИЯ, ЭМИСТИМ, МЕЛАФЕН, АДАПТАЦИЯ, МАТОЧНИК

DOI: http://dx.doi.org/10.21515/1990-4665-154-031 The article presents the results of microclonal reproduction and recovery of native grape varieties, the creation of basic nursery. In addition to the culture of apical meristems, we have developed a chemotherapy using salicylic acid. A method of decontamination of plants from mycoplasma infection has also been developed, which includes the introduction of the antibiotic Cefotaxim in the nutrient environment at a concentration of 50 to 450 mg/L, depending on the degree of infection of plants. Adding to the nutrient medium of the drug Emistim reduces the death of meristems from infection by 3-5 times, improves their differentiation. The use of the drug Melafen helps to improve morphogenesis and quality characteristics of plants. The high survival rate of meristems during adaptation to non-sterile conditions has been noted. Biological testing on herbaceous indicators showed no chronic diseases. Plants after adapting to non-sterile conditions are planted, in the form of vegetative seedlings with a closed rootsystem, on the basic nursery. The survival rate of plants was 70-80%, in some varieties it is higher: 96.4% (Sypun black) - 98.6% (Krestovsky). It has been proved that in vitro clonal microbreeding there is no change at the genetic level even after 8 years of cultivation, which confirms the reliability of the developed technology of reproduction and recovery of native grape varieties in vitro виноград сорт маточник

Keywords: ABORIGINE DON'S VARIETIES, IN VITRO, HEMOTHERAPY, EMISTEM, MELAFEN, ADAPTATION, NURSERY

Введение

Производство высококачественных и уникальных вин, прославивших виноградарство и виноделие Дона [1], связано с использованием аборигенных донских сортов винограда. Это известные всему миру красные вина высочайшего качества из урожая сортов Красностоп золотовский, Цимлянский черный, Плечистик, донские белые вина из урожая сортов Сибирьковый, Кумшацкий белый, Пухляковский и др. В настоящее время их площади значительно сократились, и возникла необходимость закладки новых насаждений этих ценных сортов винограда для высококачественного виноделия. Многие аборигенные донские сорта винограда представляют значительную ценность для использования в селекционной работе [2]. Их необходимо также сохранить для поддержания генетического разнообразия. Перспективные аборигенные сорта винограда до сих пор являются большим нераскрытым потенциалом производства ценной продукции виноградовинодельческой отрасли нашей страны [3]. Наряду с традиционными способами сохранения растений ex situ, все большее значение приобретает использование для этих целей культуры изолированных тканей и органов.

Максимальная продуктивность растений может быть достигнута при отсутствии заражения их наиболее опасными вирусами, фитоплазмами, грибными, бактериальными болезнями, нематодами и другими вредителями. Вирусным инфекциям подвержены практически все виды растений, постоянный экономический ущерб они наносят и виноградным насаждениям.

Основным методом получения безвирусного посадочного материала является культура апикальных меристем. Использование метода культуры апикальных меристем для оздоровления растений от вирусной инфекции основано на принципе отсутствия вирусных частиц в верхушке роста растений. В 1952 году Морель и Мартен [4] установили, что эффективные результаты дает культивирование меристематических верхушек в асептических условиях на искусственных средах. Авторы установили, что вирус не может существовать в клетках меристемы.

Вскоре, начиная с 50-х годов ХХ века, были предприняты первые успешные опыты по получению свободных от вирусов растений из точки роста [5]. С тех пор техника оздоровления растений, основанная на выделении апикальных меристем, стала интенсивно совершенствоваться.

Теоретически концепции, положенные в основу этого метода, стали уточнятся в последнее время. Авторы метода Morel и Martin [4] полагали, что в больном растении вирус распространяется с отставанием от быстро растущих молодых органов, особенно в молодых недифференцированных тканях, где концентрация вируса может снижаться вплоть до полного отсутствия.

В настоящее время применение электронной микроскопии часто обнаруживает наличие вирусов в меристеме пораженных ими растений. Особенность строения апикальной меристемы исключает проникновение в нее вируса путем быстрого транспортирования по проводящей системе, но допускает возможность медленного распространения через плазмодесмы, соединяющие меристематические клетки.

Таким образом, возможно присутствие вирусов в точке роста зараженного растения и репродукция их в меристематических тканях. Доказательством являются исследования, выполненные в Никитском ботаническом саду [6], подтвердившие наличие вирусных частиц в апикальных и латеральных меристемах сильно пораженного вирусами сорта цимбидиума и растений гвоздики, пораженных вирусом крапчатости (CarMV).

Исходя из этого, значительный интерес в освобождении растений от вирусов представляет использование культуры апикальных меристем в сочетании с хемотерапией. Сочетая культуру верхушечных меристем с хемотерапией, можно повысить эффект оздоровления от вирусов и коэффициент размножения оздоровленных растений.

Цель исследований - разработать методы оздоровления аборигенных донских сортов винограда от хронических заболеваний, размножить и сохранить оздоровленные растения в коллекции in vitro и на базисном маточнике.

Предметом исследования являлись аборигенные донские сорта винограда: Варюшкин, Красностоп золотовский, Крестовский, Кукановский, Кумшацкий. Пухляковский, Сибирьковый, Сыпун черный, Цимладар, Цимлянский белый и Цимлянский черный (два клона).

Материалы и методы

Исследования проводились по общепринятым в биотехнологии методикам Ф.Р. Уайт, 1949 [7], Бутенко Р.Г., 1964 [8]; Голодрига П.Я. и др., 1986 [9], Дорошенко Н.П., 1992 [10] в стационарных лабораторных условиях и на созданном базисном маточнике. За основу нами взят способ оздоровления растений при помощи культуры апикальных меристем при относительном размере эксплантов 0,1-0,2 мм, в сочетании с хемотерапией, проводимой салициловой кислотой и с антибактериальной хемотерапией, основанной на применении антибиотика Цефотаксим. Кроме этого, в изучение были включены ФАВ Эмистим и Мелафен.

Салициловая кислота, которую некоторые авторы относят к новому классу фитогормонов [11, 12], способна поддерживать целостность мембранных структур клеток при воздействии стрессовых факторов. Доказано [13], что в присутствии салициловой кислоты происходит ингибирование распространения вируса ВТМ, одной из причин которого является снижение проводимости плазмодесм и межклеточного транспорта вируса. М.Т. Упадышев, А.Д. Петрова [14], в процессе хемотерапии выявили антивирусную активность салициловой кислоты в отношении вирусов различной природы у ягодных и плодовых культур. Показано положительное влияние салициловой кислоты при клональном микроразмножении подвойных сортов винограда [15].

Цефотаксим является полусинтетическим аналогом цефалоспорина - антибиотика третьего поколения. Цефалоспорины выделяются грибами рода Cephalosporum. основной продуцент этого антибиотика - гриб вида C.acremonium. По химическому строению антибиотик принадлежит к группе лактамных соединений, близких к пенициллинам. Биологическая активность Цефотаксима связана с образованием при его разложении стимуляторов роста и морфогенеза [16].

Препарат Эмистим имеет широкий спектр действия. Он обладает слабой гибберелловой и цитокининовой активностью [17], положительно влияет на процессы роста и развития растений, снижает влияние неблагоприятных и стрессовых факторов, активирует защитные механизмы против многих патогенов [18], является индуктором устойчивости к вирусным болезням [19].

Мелафен создан в институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦРАН, представляет собой меламиновую соль бис (оксиметил)-фосфиновой кислоты. Мелафен обладает высокой полифункциональной физиологической активностью в низких концентрациях, рекомендован в качестве регулятора роста растений, отвечающего современным требованиям технологий для испытания на ведущих сельскохозяйственных культурах [20]. Известно применение Мелафена в биотехнологии [21, 22, 23], а именно в способах получения алкалоидов при выращивании культуры клеток ткани, например, Раувольфии змеиной Rauwolfia Serpentina Benth.

Культивирование проводили в культуральной комнате при освещенности 2500 лк, температуре 25-270С и фотопериоде 16 часов. Повторность каждого варианта трехкратная, в повторности 14 растений, в варианте 42 растения.

Результаты исследований

Салициловая кислота. На этапе ввода в культуру in vitro сорта Красностоп золотовский под действием салициловой кислоты уменьшилась гибель меристем от инфекции: первый этап ввода завершило в 2,8 - 3,5 раза больше меристем, чем в контроле.

Улучшилось прохождение следующего этапа собственно микроразмножения, образование новых узлов и побегов. Наибольшее число побегов образовалось и было срезано для укоренения в варианте с концентрацией СК - 0,14 мг/л больше, чем в контроле в 2,6 раза. При повышении содержания СК в составе питательной среды на этапе ввода до 1,4 мг/л новообразование побегов снижается, но всё-таки остается выше, чем в контроле (табл. 1).

Таблица 1 - Продуктивная регенерация меристем при добавлении в состав питательной среды салициловой кислоты, Красностоп золотовский, 2006 г.

Салициловая кислота отрицательно повлияла на приживаемость меристем сорта Крестовский. Из-за отсутствия развития и последующего некроза тканей погибло 39,2 % выделенных меристем. Сохранившиеся меристемы развивались медленнее, чем в контроле. Пролиферация, образование побегов, коэффициент размножения, при введении её в питательную среду, также были намного ниже, чем в контроле (табл. 2).

Таблица 2 - Репаративная и продуктивная регенерация меристем сорта Крестовский при добавлении в питательную среду салициловой кислоты и Цефотаксима, 2009 г.

Под действием салициловой кислоты произошло уменьшение растений со скрученными шиповатыми листьями и с тонкими корнями, то есть происходит оздоровление растений, дополняющее оздоровление апикальными меристемами.

Салициловая кислота, добавленная в состав питательной среды на этапе ввода, способствует улучшению адаптации меристем к условиям культивирования и регенерации из них растений; на этапе микрочеренкования применение СК в диапазоне концентраций 0,14-1,0 мг/л улучшает приживаемость микрочеренков, стимулирует корнеобразование, но ингибирует рост растений. Отмечена различная реакция отдельных сортов винограда на её применение: для подвойных сортов винограда лучшей оказалась концентрация 1,4 мг/л; для сорта Красностоп золотовский - 0,14 мг/л. Салициловая кислота способствовала улучшению качественных характеристик растений сорта Крестовский, регенерированных из меристем.