Приготовление раствора индикатора: 0,01 г. метилрота растворяют в 30 мл 960 спирта-ректификата, после чего добавляют 20 мл. дистиллированной воды. Раствор сохраняется долго в темном месте.
Техника проведения реакции: в пробирку 2-х суточной культурой изучаемых бактерий в среде Кларка добавляют 5 капель индикатора метилрота и встряхивают пробирку.
Учет реакции проводится сразу после добавления индикатора. В зависимости от величины рН, цвет культуры изменяетсярозовое окрашивание (рН ниже 5,0) положительная реакция (+), желтое окрашивание (рН выше 5,0) -отрицательная реакция (-). Желтовато-оранжевый цвет культуры указывает на сомнительную реакцию (+).
4. Реакция Фогес-Проскауэра (на образование ацетилметилкарбинола из глюкозы).
К 1 мл 2-суточной культуры бактерий в среде Кларка добавляют 0,2 мл 40%-ного водного раствора едкого калия (КОН) и 0,5 мл 6%-ного спиртового раствора альфа-нафтола. Через 3-5 минут проводят учет реакции. При наличии в культуре ацетилметилкарбинола появляется розовое окрашивание (положительная реакция), при отрицательной реакции культура окрашивается в желтый цвет. Окраска культуры в желтовато-оранжевый цвет свидетельствует о сомнительной реакции.
5. Определение способности бактерий усваивать цитратные и аммонийные соли.
Определение указанных свойств бактерий проводят на среде:
а) Козера, в состав которой входят - кислый фосфорнокислый натрий аммоний ( NaNH4 HPO4 . 4H2O) -1,5г. однозамещенный фосфорнокислый калий (КН2РО4)-1г., сернокислый магний(МоО47Н2О) - 0,2г., лимоннокислый натрий (Na3C6H5O7 . 2H2O)- 3г., дистиллированная вода - 100 мл. Смесь фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки и стерилизуют при 1200 15-20 минут. Готовая среда бесцветная. Засеянные изучаемым микроорганизмом пробирки, инкубируют при 370С в течение 2-4 суток. Бактерии, усваивающие цитратные и аммонийные соли, хорошо растут, вызывая помутнение среды. Отсутствие роста бактерий в среде Козера, указывает на неспособность усвоения цитратных и аммонийных солей (среда остается прозрачной).
б) на среде Симмонса - дистиллированная вода - 1000 мл., двузамещенный фосфорнокислый аммоний - (NH4HPO4) -1,5 г., однозамещенный фосфорный калий - КН2РО4 - 1г. сернокислый магний - MgSO4 . 7H2O -0,2г., трехзамещенный лимоннокислый натрий -0,2 г., агар - 20,0г. устанавливаемый рН - 7,2 (добавляя 10%-ный раствор NaOH и затем добавляют 10 мл 0,2% раствора бромтимолблау, и разливают по стерильным пробиркам ( по 0,5 мл.). Стерилизуют автоклавированием 15 минут при 1120С. Перед употреблением столбик среды окрашивают. Пересев культуры проводят с МПА, беря ее так, чтобы не захватить среду. Бульонная культура не используется. кишечная палочка на среде Симмонса не растет.
Приготовление индикатора бромтимолблау: бромтимолблау - 1г., 0,1N раствора NaOH -25 мл. дистиллированная вода - 475 мл. Цитратно-аммонийно позитивные бактерии дают рост с изменением среды в ярко-синий цвет. Микробы, не способные усваивать цитратные и аммонийные соли, на данной среде не растут и цвет среды не изменяется.
6. Определение способности бактерий расщеплять мочевину.
Рецепт среды: стерильный 1,7% питательный агар на мартеновском бульоне, рН -7,3 - 1000 мл. глюкозы -5г., 50%-ный раствор мочевины -20мл. 0,2%-ный раствор бромтимолблау -12 мл. Разливают в стерильные пробирки по 5 мл и стерилизуют один раз текучим паром 15 минут. Среду перед употреблением скашивают. Расщепление мочевины сопровождается изменением цвета среды с зеленоватого в ярко-синий, при отрицательной реакции среда становится желтой.
7. Обнаружение индола. Может быть проведено различными методами. Наиболее доступным и удобным способом обнаружения индола является метод с использованием индикаторных бумажек, приготовленных по одному из следующих рецептов: а) фильтровальную бумагу пропитывают насыщенным (12%) водным раствором щавелевой кислоты, затем бумагу высушивают на воздухе и разрезают на полоски размером 10 х 0,5 см. Хранят бумажки с щавелевой кислотой в стеклянной банке с притертой пробкой.
Для обнаружения индола засевают пробирки с МПБ или бульоном Хоттингера изучаемой культурой бактерий, вставляют в пробирку индикаторную бумажку, прижимая верхний конец ватно-марлевой пробкой (нижний край бумаги не должен касаться питательной среды). Инкубирование пробирок проводится при 370С 1-3 дня. При наличии индолообразования нижняя часть индикаторной бумажки окрашивается в розовый цвет (просматривать при проходящем свете). б) Фильтровальную бумагу пропитывают теплой смесью, состоящей из пара-диметил-амидобензальтегида -3-5г., 960 спирта-ректификата -50 мл. фосфатной кислоты (очищенной, концентрированной) - 10 мл. Бумагу высушивают на воздухе и разрезают на полоски. Цвет готовых бумажек желтый. Хранить следует в стеклянной банке с притертой пробкой.
Обнаружение индола проводят также, как и с бумажками, пропитанными щавелевой кислотой. При наличии нидола нижний край бумажки изменяет цвет, становится от сиренево-розового до интенсивно-малинового оттенка. Окрашивание индикаторами бумажки в другие цвета не учитывается.
8. Обнаружение сероводорода. Проводят на плотной среде следующего состава, которую готовят в два этапа.
1 день - готовят агаровую основу - 10,7%-2% агара - 100 мл. Стерилизуют в автоклаве при 1200 30 минут, предварительно профильтровывая его.
2 день - добавляют сернокислое железо FeSO4 -0,2 г. гипосульфит -0,3 г., глюкозу -1г. индикатор фенолрот 0,3%-ный -12 мл.
Стерилизация текучим паром -20 минут. Посев проводят на окрашенный агар, проколов нижнюю часть столбика среды. При положительной реакции покрасневший столбик среды дает черную окраску в своей нижней части. При отрицательном результате почернения среды не наступает.
2.1 Дифференциальная диагностика
При постановке диагноза на колибактериоз необходимо его дифферинцировать от ниже следующих болезней (Таблица 1).
Таблица 1. Дифференциальная диагностика колибактериоза от сходных болезней птиц по патанатомическим изменениям
|
Колибактериоз |
Пуллороз-тиф |
Пастереллез |
|
|
Колибактериоз - энзоотическое заболевание цыплят, утят, индюшат в возрасте от 3 до 14 дней. У птенцов, павших в период болезни острым колибактериозом обнаруживают пат-анатомические изменения, характерные для септически протекающих заболеваний. Отмечается большое количество мелких точечных кровоизлияний во всех внутренних органах, на серозе кишечника эпикарде и эндокарде. Стенки слепых и тонких кишок значительно гиперемированы. Селезенка уплотнена и увеличена в несколько раз, при сгибании образуются трещины. Околосердечная сумка часто бывает наполнена серозным экссудатом. Легочная ткань гепатизирована, серовато-красного цвета. |
Пуллороз-тиф - (бациллярный белый понос, бациллярная дизентерия цыплят, бациллярная белая диарея) - инфекционное заболевание, остро протекающее у цыплят в скрытой форме, хронически у взрослой птицы. В первые дни жизни цыплят бросается в глаза большой не рассосавшийся желток нередко окрашенный в бурый или зеленоватый цвет. Печень увеличена, светло-желтого цвета, а у цыплят более старшего возрастов - глинистого цвета. Селезенка также увеличена, светло-коричневого цвета. В клоаке - скопление жидкого, белого меловидного кала. Характерны некротические поражения в печени и селезенке, легких, сердечной мышцы. Некротические очаги в печени и селезенке имеют вид серо-белых мелких пятнышек, величиной в булавочную головку. Очаги в легких и сердечной мышце бывают в виде бугорков величиной от просяного зерна до мелкой горошины и крупнее. |
Пастерелез птиц (холера птиц, геморрагическая септицемия) - острое, иногда подострое или хроническое инфекционное заболевание, поражающее все виды птицы. В типичных случаях они характеризуются петехиальными кровоизлияниями в слизистых оболочках и высокой смертностью. При остром течении болезни находят геморрагии в глубоких слоях кожи подкожной клетчатке, почти всегда кровоизлияния различной величины на серозных оболочках и жира в области живота, на эпикарде, брюшине, брыжейке, серозе кишок, грудине, половых органах (яичниках). Сердечная сумка наполнена экссудатом. Сердце почти всегда покрыто многочисленными геморрагиями и кажется, как бы, забрызганы кровью. Другие внутренние органы отечны, и сосуды наполнены кровью. Наблюдаются признаки энтерита, причем наиболее выражено воспаление двенадцатиперстной кишки. |
|
|
Псевдомоноз |
Респираторный микоплазмоз |
Кокцидиоз |
|
|
Псевдомоноз - заболевание встречающее у цыплят. Печень увеличена с серовато- белыми очажками. Легкие полнокровны, на поверхности - обширные кровоизлияния, селезенка увеличена в 2-3 раза, пульпа вишневого красного цвета с очагами кровоизлияния. Сердце увеличено и гиперемировано, мышца дряблая и бледная. На миокарде кровоизлияния и некротические фокусы. |
Респираторный микоплазмоз птиц - инфекционное контагиозное заболевание цыплят, кур и индеек, вызываемое полиморфным микроорганизмом. Если птица погибает в начальный период болезни или её убивают, то обнаруживаемые изменения не характерны. Носовые полости, инфра-орбитальные синусы, трахея бывают заполнены тягучей клейкой жидкостью, плотно прирастающей к слизистой. Стенки воздухоносных мешков непрозрачны, уплотнены, покрыты слизью. В более поздних стадиях заболевания в просвете трахеи находят экссудат, в легких - уплотненные участки, а иногда узелковые образования, стенки воздухоносных мешков уплотнены, воспалены. У многих птиц обнаруживают мутные наложения в виде творожистых хлопьев или пленок на стенках воздухоносных мешков или внутри их. |
Кокцидиоз (эймериоз) - заразное заболевание молодняка птиц с поражением кишечника или почек (гусей), вызываемое простейшими одноклеточными организмами, относящимися к классу споровиков. Мышцы, гребешок и сережки у павших цыплят бледные, слепые отростки растянуты и переполнены излившейся кровью, а иногда - наполнены белой, творожистой массой. Слизистая оболочка слепых отростков при наличии Eimeria tenella изъязвлена. |
|
|
Колигрануломатоз |
Классическая чума птиц |
Болезнь Ньюкасла |
|
|
Колигрануломатоз (болезнь Хьярре) - инфекционная болезнь птиц, протекающая с образованием специфических гранулем во внутренних органах прежде всего в стенках слепых отростков кишечника, печени и на коже. Возбудитель разновидность Escheri-chia coli капсулообразующий вариант. К возбудителю восприимчивы птицы семейства куриных. У молодняка птиц 2-4 месячного возраста регистрируются энзоотии, характеризующиеся высокой летальностью (70-100%). Отмечается общее истощение и малокровие. Слизистые оболочки бледные, слабая желтушность. Специфические гранулемы в печени и слепых кишках. В кишечнике бывают гранулемы, свисающие на ножках и сращенные на слизистых оболочках. В печени бывают милиарные «завязи» и крупные узловатые конгломераты. Паренхима печени атрофирована. В центре узелка обнаруживаются кистозные расширения с загустевшим зеленовато-бурым содержимым. Катаральные воспаления кишечника. |
Контагиозное септическое заболевание с высокой (до 100%) смертностью. Заболевают птицы всех возрастов отряда куриных. Общие септические изменения и тяжелые сосудистые расстройства в виде многочисленных точечных и пятнистых кровоизлияний и обильной в подкожной клетчатке и полостях тела серозной жидкости. Дистрофические изменения паренхиматозных органов и воспаление слизистых оболочек респираторных органов и пищеварительного тракта и мозга. Упитанность - средняя, слизистая оболочка рта, носа покрыта слоем тягучей слизи, оболочка набухшая, покрасневшая. Полость сердечной сорочки и груди содержит серозный инфильтрат с хлопьями фибрина. Кровоизлияние в железистом отделе желудка и на границе с мускульным желудком в виде пояска. В слизистой кишечника катаральные и катарально-геморрагические воспаления. Печень, почки дряблые, сероглинистого цвета. |
Острое контагиозное заболевание, преимущественно молодых птиц отряда куриных. Поражаются респираторные системы, а также центральная нервная система. Течение болезни сверхострое (у цыплят первых дней жизни), острое (1-5 дней), иногда затяжное до 10-15 дней. Патологоанатомическая картина аналогична классической чуме птиц. |
|
|
Гипо-и авитаминоз птиц |
Оспа птиц |
Инфекционный ларинготрахеит |
|
|
Хроническое заболевание птиц вследствие недостатков или отсутствия в организме витаминов А и его провитамина-каротина. Исхудание и бледность слизистых оболочек, кожа сухая, шероховатая. На слизистых оболочках дыхательных и пищеварительных органов творожистые отложения, скопления детрита в протоках желез с образованием плотных, белых узелков. Выпадение уратов в почках с образованием зерен, кристаллов, камней, развитием гидронефрозов и нефросклерозов (висцеральный мочекислый диатез). В паренхиматозных органах и костной ткани-дистрофические изменения (остеопорез). |
Контагиозное заболевание, поражающее всех возрастов. Протекает в двух формах: кожной (оспенной) и дифторитической - с поражением слизистых оболочек рта, гортани и глаз. При кожной форме поражаются гребень, сережки и бородки, где вначале образуются серые, отрубевидные налеты, а затем узелки. Вначале они имеют красновато-серый цвет. В конце заболевания они превращаются в темно-коричневый цвет. При дифтеритической форме вначале на слизистой оболочке появляется мелкая сыпь в виде желтовато-белых пятнышек, которая постепенно расширяется образуя целые наслоения. Они желтоватого цвета и плотно соединены с подслизистым слоем. При их удалении обнаружится красноватая, бугристая поверхность. Они несколько утолщены, углубленные и легкокровоточащие эрозии. Для оспы птиц характерны наличие в эпителиальных клетках телец - включений (тельца Боллингера). |
Энзоотическая контагиозная болезнь кур всех возрастов. Поражается гортань и трахея, конъюнктивы глаз. Протекает в двух формах: ларинготрахеальная и конъюнктивальная. При первой -просвет гортани и трахеи заполнены фибринозно-геморрагическим экссудатом, часто со сгустками крови. Иногда заполнены фибринозно-казеозной массой в виде пробки, закрывающей щель горта-ни. Катарально-фибриоз-ное воспаление отмеча-ется в слизистой носовой полости иинфраорбиталь-ных синусах. Конъюнктивальная (атипичная) форма сравнительно редкая и поражаются часто конъюнктивы глаз, (влажный глаз). Конъюнктива гиперемирована, отечная, иногда с точечными кровоизлияниями. Отекают нижние веки. Часто возникает помутнение роговицы и развитие панофтальмита. |
|
|
Инфекционный бронхит |
|||
|
Острая высококонтагиозная болезнь, характеризующаяся коротким инкубационным периодом (18-36 ч.). Восприимчивы все возраста, особенно цыплята младшего возраста. В верхних дыхательных путях накапливается серозно-казеозный экссудат. Слизистая гиперемирована и отечная. Сильно поражаются слизистая носовой и инфраорбитальных синусов. Легкие наполнены кровью. Слизистая бронхов и перибронхиальных зон утолщена. Иногда вокруг бронхов отмечаются развитие мелкоочаговой пневмонии. Стенки воздухоносных мешков утолщены, они непрозрачные. В полостях содержится прозрачный пенистый экссудат с хлопьями фибрина и фибринозно-казеозной массы. У кур-несушек поражаются яйцевод и яичник. Яйцевод уменьшается в длине, а яичник в объёме. Фолликулы его атрофированы. У переболевших кур в течении месяца наблюдаются инфантильность яйцевода и яичника. Иногда отмечается желточный перитонит. |
2.2 Чувствительность кишечной палочки к антибиотикам
Чувствительность выделенных штаммов кишечных палочек определяют общепринятым методом - методом диффузии в агар с использованием бумажных дисков. Этот метод является качественным и позволяет разделить испытуемые культуры на чувствительные и устойчивые.
На поверхность плотной питательной среды, разлитой в чашки Петри примерно по 20 мл, наносят испытуемую бактериальную, либо смыв 18-20 часовой культуры с МПА. Плотность суспензии должна соответствовать стандарту мутности № 10 ГНКИ им.Тарасевича.
Взвесь равномерно распределяют по чашке, остаток жидкости отсасывают пастеровской пипеткой. Чашки подсушивают при комнатной температуре 30-40 минут, затем на поверхности чашки пинцетом размещают диски с антибиотиками. Бумажные диски заводского изготовления содержат одну концентрацию антибиотика (за исключением дисков) с карбенициллином, который содержат 2 концентрации - 25 мкг для определения чувствительности у штаммов эшерихий)
На одну чашку следует помещать 6-10 дисков на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 2 см от края чашки. Чашки инкубируют при 370С в течении 18 час. В перевернутом вверх дном положении.
Учет результатов проводят линейкой: диаметры зоны задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр диска.
В ветеринарной практике для предупреждения кишечных болезней птиц применяется комплекс технологических и санитарных мероприятий, а также используются антибиотики и различные нитрофурановые препараты (Л.А.Мулланаева, 1991; М.З.Шипшева, 1998). Однако применять их надо рационально с учетом выбора схем, доз, кратности и эпизоотической ситуации в хозяйстве. Длительное использование антибиотиков приводит к повышению штаммов E. coli, устойчивых к данным препаратам, что в значительной степени снижает эффективность лечения. По мнению ряда ученых (В.И. Ежов, 1975; Т.Н.Исхакова, 1975; А.И.Ивашура, 1972; Е.Чермева, П.Каранванов, 1981; В.Глодов и соавт., 1981; Р. Fakhrradegan, 2002) перед выбором отдельных препаратов и их сочетаний рекомендуется проводить выделенные штаммы E. coli на бактериостатическую к бактерицидную активность.
Для более эффективного применения лечебных препаратов в борьбе с колибактериозом необходимо определить серологическую принадлежность и патогенность выделенных штаммов кишечной палочки, создать карты их бактериостатической и бактерицидной чувствительности, периодически контролировать и обновлять эти данные.
В результате наших исследований Ф.А.Ниязов и соавт.(2001) было установлено, что все штаммы возбудителя колибактериоза в зависимости от степени их чувствительности к антибиотикам и нитрофурановым препаратам можно разделить на четыре группы. В первую группу входят высокочувствительные штаммы возбудителя, рост которых приостанавливается при концентрации препарата до 3 ед., во вторую средне чувствительные с задержкой роста при дозе препарата от 5 до 20 ед.; в третью - с низкой чувствительностью от 50 до 100 ед. и четвертую группу - штаммы, обладающие высокой устойчивостью к отдельным антибиотикам (концентрация препарата свыше 100 ед. на 1 мл питательной среды.
Большинство выделенных в настоящее время штаммов колибактериоза имеет высокую устойчивость к названным выше препаратам. Однако у 40% из них отмечена высокая чувствительность к неомицину, у 52% - к полимиксину, у 40% - к левомицетину, у 66% к синтомицину и у 36% - к фуразолидону.
Наблюдения показывают, что устойчивость штаммов возбудителя к этим препаратам зависит от частоты их применения в хозяйстве, а также избирательной активности отдельных из них. Отмечено и то, что использование фуридина и фуразолидона в комбинации с антибиотиками повышает их активность в 1,7-12,6 раз.
Но менее важным при выборе препарата является определение его бактериостатических и бактерицидных доз между которыми могут быть значительные колебания.
2.3 Меры борьбы и профилактики
С целью недопущения распространения колибактериоза птиц следует тщательно выполнять организационно-хозяйственные, зоотехнические и ветеринарно-санитарные мероприятия, согласно Ветеринарно-санитарным правилам для птицеводческих хозяйств (ферм) и требованиям при их проектировании (Л., 1982 г.)
Особое внимание необходимо обращать на:
- комплектование племенного стада птицей из благополучных хозяйств;
- размещение различных возрастных групп птиц в территориально обособленных зонах с необходимыми санитарными разрывами;
- соблюдение межцикловых профилактических перерывов при заполнении цехов одновозрастной птицей;
- создание оптимальных зоогигиенических условий содержания птиц, их полноценное кормление по рационам, сбалансированным по питательным и биологически активным веществам, витаминам и микроэлементам;
- заготовка, отбор и дезинфекцию полноценных яиц, предназначенных для инкубации.
Для санации производственных помещений и территории хозяйств вначале проводят их тщательную механическую очистку, а затем дезинфекцию в порядок и в сроки, как того требует Инструкция по проведению ветеринарной дезинфекции животноводческих объектов (М., 1989 г.).
Периодически проводят аэрозольную дезинфекцию помещений в присутствии птицы, для чего используют пары хлор-скипидара на 1 м3 помещения, из расчета 2 г хлорной извести и 0,5 мл скипидара. Экспозиция - 30 минут. Для дезинфекции могут быть использованы высокодисперсные аэрозоли резорцина или йодтриэтиленгликоля (20%-ный раствор), а также 1%-ный раствор хлорамина, 3%-ный раствор гипохлорита, 40%-ный раствор формалина, 50%-ный раствор молочной кислоты.
При обработке руководствуются Инструкцией по проведению аэрозольной дезинфекции птицеводческих помещений в присутствии птицы (М., 1974 г.).