Материал: Іутинська Г.О. Ґрунтова мікробіологія

Б іохім ія азот ф іксації. Зв'язування азоту у мікроорганізмів відбувається завдяки нітрогеназам; у загальному вигляді описується рівнянням:

Нітрогєназа

Л/і + 5Н* + 8 в +16 АТФ%2 Л/Н3 + Н2+ 16АДФ+16 Фн.

Як видно з рівняння, процес фіксування азоту е енерговитратним. Підраховано, що на цю реакцію, а також синтез нітрогеназ та обслуго­ вуючих їх ферментів на 1 г фіксованого азоту витрачається 100-200 г глюкози.

Вивчення нітрогеназ показало, що за багатьма ознаками вони є уні­ кальними серед ферментів. Нітрогеназний комплекс складається із біл­ ків трьох тилів - а, р і у, а також двох кофакторів: залізо (Ре)-вміщую- чого і молібден-залізо (МоРе)-вмІщуючого. Виявлена також нітрогєназа, що не містить металів.

Нітрогєназа має дві субодиниці: компонент І - складається з малої

Виявлені також альтернативні нітрогенази, у яких молібден заміще­ ний ванадієм або вольфрамом. Альтернативні нітрогенази, як і MoFe- нітрогеназа, складаються з двох компонентів та інактивуються при кон­ такті з киснем.

Унікальною є здатність альтернативних нітрогеназ відновлювати ацетилен (СгН2) до етану (СгНв), завдяки чому їх можна відрізнити від MoFe-нітрогенази, яка відновлює ацетилен до етилену (С2Н<). Альтер­ нативні нітрогенази виявлені у Azotobacter chroococcum, A.vinelandii, A.paspalii, Anabaena variabilis, Rhodobacter capsulatus.

Існування декількох типів нітрогеназ надає діазотрофам додаткову можливість для азотфіксації за умов дефіцитного забезпечення Мо чи Ре.

Нітрогєназа має низьку субстратну специфічність і може відновлю­ вати не тільки Ni, а також інші сполуки, з потрійним зв’язком: ацетилен, закис азоту, ціанід, циклопропіл, метилацетилен, азид, а також іони во­ дню Н* до молекулярного водню Нг.

106

Нітрогеназа чутлива до вільного кисню й »активується навіть при незначних його концентраціях. Для функціонування нітрогенази необ­ хідне джерело енергії і надходження електронів. Для отримання енергії найбільш ефективними шляхами є окислювальне фосфорилювання і фотосинтез, у анаеробних азотфіксатарів - бродіння. Сполучення цих енергетичних процесів з фіксацією азоту ускладнюється через пригні­ чення нітрогенази киснем. Тому аеробні мікроорганізми-азотфіксатори мають ряд механізмів для захисту нітрогенази від кисню, при цьому зберігають можливість отримання енергії окислювальними шляхами. У вільноіснуючих діазотрофів це може бути досягнуто тим. що гени, які кодують нітрогеназу, активуються тільки в анаеробних або мікроаерофільних умовах. Деякі азотфіксуючі бактерії мають щільну оболонку (гетороцисти ціанобактерій, полісахаридні капсули), яка повільно пропускає кисень. У бульбочкових бактерій І ендофітних азотфіксаторів функцію захисту нітрогенази виконує рослина-живитель.

Була відкрита альтернативна супероксцд-залежна СОЗ-нітрогеназа, яка стабільна при контакті з киснем і навіть потребує його. СОЗ-нітро- геназа є трикомпонентною.

Будова нітрогеназ є універсальною для всіх азотфіксуючих бакте­ рій. Доказом універсальності є дані про те, що штучна нітрогеназа, яка складається з компонентів, взятих у різних бактерій, відновлює свою активність.

Синтез нгтрогеназ кодується складною системою ллГ-генів. Так, на­ приклад, у добре вивченого азотфіксатора Klebsiella pneumoniae ця сис­ тема включає 25 генів, які зібрані в один кластер із семи транскрипційних одиниць. Гени пан, піЮ, пОК кодують структуру a-, ß- і у-білків нітроге­ нази; гени пОМ, nifS, паи, nrfY - процесінг цих білків. Гени rûfВ, пОЕ, nifN, nOV контролюють синтез MoFe-фактора. Крім того, л/іГ-оперон бактерії містить два регуляторних гени: піїА кодує білок, що активує транскрип­ цію генів nifHDK, а також інших nrf-генів. Навпаки, продукт гену nifL реп­ ресує транскрипцію л#-генів за присутності кисню.

У подальшому з аміаку, синтезованого з атмосферного азоту, утво­ рюються амінокислоти. ЦІ реакції каталізують ферменти глютамін- і глютаматсинтетази.

В Іл ь н о Іс н у ю ч і а зо т ф іксую ч і м ікр о о р г а н ізм и . На тепе­ рішній час відомо більш як ЗО видів мікроорганізмів, здатних фіксувати азот атмосфери, які існують у ґрунті як хемоорганогеторотрофні та фототрофні організми.

Великий вклад у фіксування атмосферного азоту вносять предста­ вники групи азотобактерів, до якої належать роди Azotobacter,

107

Аготопаз, Веуегіпскіа. До роду АгоіоЬасіег відносять аеробні грамнегативні мікроорганізми. Молоді клітини за морфологією є рухомими палич­ ками розміром 2-Зх4-6 мкм; при старінні вони перетворюються на круп­ ні коки діаметром до 4 мкм або клітини неправильної форми, розміщені пооодинока, парами або групами. Палички втрачають джгутики і мають полісахаридну капсулу; аероби, мезофіли, хемоорганогетеротрофи, фік­ сують молекулярний азот, продукують біологічно активні речовини.

Найбільш часто у ґрунті зустрічаються такі види як А.сЬгоососсит (продукує буро-коричневий пігмент), АМпеіапвіі (продукує зеленуватожовтий пігмент з флюоресценцією), А.адіІе (продукує світло-жовтий піг­ мент з флюоресценцією), А.Ьецегіпскіі (колонії мають світло-коричневий колір), Апідгісапз (колонії від чорного до фіолетового кольору).

Як джерела азоту азотобактери засвоюють солі амонію, нітрати, ніт­ рити, амінокислоти, а за їх відсутності - фіксують молекулярний азот. Кількість фіксованого цими мікроорганізмами азоту може сягати 15-20 мг N на 1 г засвоєного органічного субстрату. Як енергетичний субстрат використовують моно- і дисахариди, деякі полісахариди, спирти, органі­ чні кислоти, в тому числі ароматичні. Висока потреба цих мікроорганіз­ мів у елементах живлення (особливо фосфорі, калії, кальції) зумовлює розповсюдження їх у високородючих ґрунтах із нейтральною реакцією. Азотобактери чутливі до пестицидів і токсичних йонів важких металів. Тому кількість азотобактеру у ґрунті часто використовують як індикатор сприятливих умов для вирощування сільськогосподарських рослин. Азотобактери синтезують біологічно активні сполуки, які стимулюють ріст рослин, проявляють антагоністичні властивості до фітопатогенних бактерій. Завдяки цим корисним властивостям їх використовують як ос­ нову бактеріального добрива - азотобактерину (див. розділ 10.1). Азо­ тобактер виявляється не тільки у ґрунтах. Існуть дані щодо активної ко­ лонізації азотобактерами зони коренів рослин, а також проникнення йо­ го у внутрішні тканини кореня; показана також можливість Існування їх як епіфітів на рослинах. Це дає підставу відносити представників азото­ бактерів також і до асоціативних азотфіксаторів.

Мікроорганізми роду Веуегіпскіа поширені у кислих ґрунтах суб­ тропічної зони, рідше зустрічаються у ґрунтах зони помірного клімату. Клітини бактерій роду Веуегіпскіа мають різноманітну морфологію - па­ лички, коки, можуть бути рухомими, іноді утворюють капсули. Не засво­ юють ароматичні сполуки, а при рості на вуглеводах накопичують у се­ редовищі органічні кислоти. Можуть рости при широкому діапазоні рН: від 3,0 до 9,5. Здатні фіксувати до16-20 мг N на 1 г вуглеводів.

108

Ентеробактери - факультативно-анаеробні грамнегативні палич­ ки. Серед цієї групи здатність до азотфіксації мають Enterobacter aemgenes, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter intermedius, Xanthobacter flavus. За морфологічними ознаками - це палички поодинокі, рухомі із перитрихіальними джгутиками, факультативні анаероби, здатні до окиснення в аеробних і до бродіння - в анаеробних умовах, хемоорганогетеротрофи. Зустрічаються переважно у лісових підзолистих і лугових ґрунтах при низьких значеннях pH і низьких температурах. Деякі пред­ ставники є ендофітами рослин.

Серед вільно існуючих діазотрофів е представники грампозитивних слороутворюючих бактерій; аеробні види (Bacillus subtilis, B.polymyxa) і анаеробні клострідії. переважно сахаролітичної групи

(Clostridium pasteurianum, C.butiricum, С.acetobutiricum, C.pectinovorum). Першою з анаеробних слороутворюючих бактерій була відкрита у 1893 р. С.М. Виноградським Clostridim pasteurianum. Молоді кліти­ ни цієї бактерії мають форму перитрихіальних паличок 0 ,8 -1 ,3x1,5 - 8,0 мкм. При споруляції клітини потовщуються і утворюється спора, діаметр якої перевищує товщину паличок. Спори можуть розміщува­ тися термінально або посередині клітини. Культура продукує поліса­ хариди, які утворюють капсули. Як джерело азотного живлення мо­ жуть використовувати солі амонію, нітрати, амінокислоти, за їх відсу­ тності починають фіксувати молекулярний азот. Джерелом енергії слу­ гують вуглеводи, органічні кислоти. Енергію отримують в результаті бродіння.

Азотфіксуючі клострідії широко розповсюджені у ґрунтах різних ти­ пів, а також у рисових чеках, мулі каналів зрошення. Активний розвиток цих бактерій спостерігається за умов збагачення ґрунту свіжою органіч­ ною речовиною. Як облігатні анаероби вони утворюють асоціації з ае­ робними бактеріями, aid споживають кисень і тим самим забезпечують сприятливі умови життєдіяльності для анаеробів.

Клострідії можуть фіксувати до 20 мг Лі на 1 г вуглеводів. Збага­ чення ґрунту свіжою органічною речовиною (гній, солома) сприяє роз­ витку азотфіксуючих кпострідій, анаеробна фіксація може досягати 2 - 5 кг Лі на 1 га.

Здатність до фіксації азоту мають фототрофні ціанобактерії. Се­ ред азотфіксуючих ціанобактерій є одноклітинні форми (Glotothece, Synechococcus, Demjocarpa); багатоклітинні (Anabaena, Nostoc, Ficherella)

та представники родів, які утворюють гетероцисти або не утворюють їх

(Osdllatoria, Pseudoanabaena, Lyngbya).

109

За морфологією можуть бути одноклітинними, багатоклітинними, нитчастими, останні у вигляді трихом. Утворюють гвтероцисти й акінети з товстою оболонкою.

Ціанобактерії використовують енергію світла за допомогою пігмен­ тів. Для більшості ціанобактерій характерна наявність системи внутріш­ ньоклітинних мембран, які містять хлорофіли, каротиноїди та компонен­ ти фотосинтетичного апарату. Парні мембрани утворюють диски - тилакоїди; виявлені також карбоксисоми з рибулозобісфосфаткарбоксилазою, яка бере участь в асиміляції С 02 через цикл Кальвіна. Особливі­ стю ціанобактерій є наявність ціанофіцину - азотвмісного запасного продукту, що є пептидом аргініну і аспарагінової кислоти. У ціанобактерій виявлені пігменти: хлорофіл а, багато видів синтезують р-каротин, ехіненон (4-кето-р-каротин) і зеаксантин (3,31-дигідро-р-каротин), всього виявлено більш як 20 каротиноїдів. Усі ціанобактерії утворюють фікобіліпротеїни червоного або блакитного кольору, що містяться у фікобілісомах і слугують для поглинання світла в області 500-660 нм. Хлорофі­ ли, каротиноїди і фікобіліпротеїни мають функцію збирання світла для фотосистеми.

Для переносу електронів у ціанобіктерій поряд із НАД і флавінами є також пластоцганін (мідьвмісний білок), ферредоксини (2Ре-23)-типу, пластохінони, цитохроми с, деякі філохінони.

Більшість ціанобактерій - облігатні фототрофи й аероби, такі як представники родів б/оФ№есе, АпаЬавпа, РєеисІоапаЬаепа. У фотогетеротрофних умовах (при освітленні і використанні окрім С 02 органічних сполук) ростуть ЗупесЬососсиє, ЗупесЬосуБІЇз, Оегтосарва, Ріеитсарєа, ОзсіШогіа, ИозЬс. В органотрофних умовах (у темряві і при викорис­ танні вуглеводів і органічних кислот) можуть рости багатоклітинні форми

ОзсіНаіогіа, Л/овіос, і-упдЬуа та одноклітинні І>упесЬососси5.

Асиміляція С02 за присутності світла відбувається оксигенним шляхом з виділенням кисню і описується рівнянням:

СОі + Н20 ^ (С Н20) + о2.

Донором електронів у цій реакції виступає вода.

За присутності світла в анаеробних умовах для асиміляції С 02аноксигенним шляхом, як донор електронів використовують сульфід:

С02+ НгО) +Н20 +2 Я*.

Деякі ціанобактерії можуть рости при освітленні і використовують при цьому не тільки диоксид вуглецю, а й органічні речовини, тобто рос­ туть у фотогетерогрофних умовах.

110