Влияние растворов противогололёдной смеси на Moina macrocopa и Allium cepa в биотестовом эксперименте
Т.С. Лопатина, Ю.В. Александрова, О.В. Анищенко, И.В. Грибовская, Н.А. Оськина, Т.А. Зотина, Е.С. Задереев
Институт биофизики СО РАН, Красноярский научный центр СО РАН, г. Красноярск, Россия. Сибирский федеральный университет, г. Красноярск, Россия
В острых и хронических тестах исследовано действие растворов противогололёдного материала «Бионорд», содержащего в своём составе хлориды натрия и кальция (до 85% от общего состава), на параметры роста и размножения ветвистоусого рачка Moina macrocopa и лука репчатого Allium cepa. Установлена гибель 50% рачков при концентрации антигололёдной смеси в растворе 5,1 г/л в острых 48-часовых тестах. В хронических тестах смесь в диапазоне концентраций 0,3 5,0 г/л не оказывала значимого влияния на среднюю продолжительность жизни, удельную скорость ювенильного роста и плодовитость самок рачков. Средняя длина корней, суммарная длина корней на каждой луковице и пролиферативная активность в кончиках корней (митотический индекс) лука снижались на 50% по сравнению с контролем при концентрациях смеси в растворе 6,3; 5,2 и 10,4 г/л соответственно. Электропроводность растворов смеси, оказавших негативное влияние на выбранные тест-объекты, совпадала с ранее полученными значениями электропроводности растворов хлорида натрия, токсичных для ракообразных. На основании этого можно предположить, что основное действие противогололёдной смеси «Бионорд» на исследуемые объекты связано с входящими в её состав солями хлора и натрия. Основываясь на критических для роста и развития использованных тест-объектов концентрациях смеси «Бионорд» в растворе и нормативах ее применения установлено, что сток с 1 м2 обработанной поверхности может привести к загрязнению 8 13 л пресной воды. Таким образом, регламентированная правилами использования препарата очистка обработанных поверхностей от «Бионорда» - базовое требование к применению солесодержащих средств. Иначе постепенное накопление в водоёмах хлоридов натрия и кальция может привести к серьёзным нарушениям в функционировании водных экосистем.
Ключевые слова: солёность; биотестирование; ветвистоусые ракообразные; Allium-тест; водные экосистемы.
Tatiana S Lopatina, Yuliyana V. Aleksandrova, Olesya V. Anishchenko, Iliada V. Gribovskaya, Nataliya A. Oskina, Tatiana A Zotina, Egor S. Zadereev
Institute of Biophysics, Federal Research Centre Krasnoyarsk Scientific Centre, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Krasnoyarsk, Russian Federation
Siberian Federal University, Krasnoyarsk, Russian Federation
The effect of deicing salt solutes on Moina macrocopa and Allium cepa in a toxicity test experiment
Chloride salts are the most commonly used deicing materials for winter maintenance of roads. Numerous studies indicate a significant increase in the salinity of aquatic ecosystems associated with the long-term use of deicing materials in countries located in cold climates. The functioning of ecosystems largely depends on salinity, since salinity is one of the key factors determining the species composition, the structure of food webs and the productivity of aquatic communities. Given the growing threat of salinization of groundwater and surface waters, it is extremely important to study the effect of deicing materials on the biota and functioning of aquatic ecosystems. The aim of this research is to determine the threshold concentrations of solutions of the deicing salt mixture “Bionord” containing sodium and calcium chlorides, at which negative effects on the development of animal and plant test objects are observed.
In this study, we used the salt-containing mixture “Bionord” as a model deicer. Similarly, with the most commonly used ice melting chemicals, the «Bionord» salt mixture contains a large amount of sodium and calcium chlorides (about 85% of the total weight). To evaluate the toxicity of the deicer solutions, we used acute and chronic toxicity tests with cladoceran Moina macrocopa (Straus, 1820) (Cladocera: Moinidae) and standard onion-based test with Allium cepa L. (Liliopsida: Amaryllidaceae) (Allium-test). In acute and chronic toxicity tests with Cladocera, the females on the first day of their life (body size 0.5-0.6 mm) were placed individually in jars with aged (not less than for 72 h) tap water with a volume of 20 ml with the addition of a deicer at a certain concentration. A group of animals that was placed in the medium without the deicer was used as a control. In the acute toxicity tests, we used the following concentration of the deicer: 1.3; 2.5; 4.0, 5.0; 6.0; 8.0; 10.0 g/l. The mortality of animals was recorded 24 and 48 hours after the start of the experiment. The concentration of the deicer (LC50) at which 50% of animals was observed to die, compared to the control, was determined in the acute toxicity test. In a chronic toxicity test, animals were tested in the following range of concentrations of the deicer: 0.3; 0.6; 1.3; 2.5; 5.0; 6.0 and 8.0 g/l. The chronic toxicity test was conducted until the death of all test animals. Based on the data obtained in the chronic toxicity test, the specific growth rate of juvenile females, average fecundity, and average life span of M. macrocopa were calculated for each concentration of the deicer. Bulbs of onions of the Stuttgartenrisen variety with a diameter of 1.8 ± 0.1 cm and a weight of 2.27 ± 0.17 g were used in the onion test.
Bulbs with their bottoms were placed in test tubes containing 20 ml of a solute of the deicer or tap water for 48 hours. Three bulbs were tested for each concentration and for the control. The following concentrations of the deicer were used in the onion test: 1.0; 2.5; 5.0; 7.0; 10.0; 15.0; 20.0; 50.0 g/l. The general toxic and cytotoxic effects were evaluated in the onion test. The average root length and the total root length on each bulb were used as indicators of the total toxicity of the solutions of deicer. To evaluate proliferative activity, we calculated the mitotic index as the fraction of dividing cells in the apical root meristem to the total number of cells. Based on the results of the experiments, we determined median effective mixture concentrations (EC50) at which there is a 50% decrease, compared to the control, in the values of root growth indicators: average root length, sum of root lengths on each bulb and mitotic index.
Median lethal concentration (LC50) of the deicing salt determined in the 48-hour acute toxicity test with females of M. macrocopa was equal to 5.1 g/l. In the chronic test, we showed that the exposure to the solutions of the deicing salt in the range of concentrations from 0.3 to 5.0 g/l does not affect the life span, specific growth rate of juveniles and fecundity of females ofM. macrocopa. The median effective concentration (EC50) of the deicing salt determined in the Allium-tests were 6.3, 5.2 and 10.4 g/l for the sum of root lengths, average root length on each bulb and proliferative activity at the tips of roots (mitotic index), respectively (See Table 1 and 2). Complete inhibition of onion root growth was observed at the concentration of the decider equal to 20 g/l, while the death of all test animals in the acute toxicity test occurred at the concentration of the deicer equal to 8,0 g/l (See Fig. 1).
Thus, we demonstrated that similar concentrations of the deicer induced 50% inhibition of the growth of onion roots and 50% mortality of cladocerans. These values, in general, corresponded to a critical salinity of 5-8 %o above which qualitative changes occur both in the external and internal condition of aquatic animals. The electrical conductivity of the deicer solutions, which had a negative effect on the selected test species, coincides with the previously obtained values of the electrical conductivity of sodium chloride solutions harmful to cladocerans.
We can assume that the main mechanism of the effect of the deicing material that we study is associated with the biological effect of its chlorine and sodium salts.
Taking this into account, the value of electrical conductivity measured for solutions of deicing salt can be used to assess its negative potential effects.
We estimated that in the absence of timely cleaning, regulated by the rules for using the material, the runoff from each square meter of the treated surface can lead to the pollution of 8-13 liters of fresh water.
Thus, the basic requirement for the use of deicing salts on roads is the need to comply with the cleaning regime of the treated surfaces.
Otherwise, the gradual accumulation of sodium and calcium chlorides in water bodies can cause an increase in salinity which will affect the survival of freshwater aquatic organisms and lead to serious disturbances in the functioning of aquatic ecosystems.
Key words: salinity; toxicity test; Cladocera, Allium-test; aquatic ecosystems.
Введение
Антропогенное химическое загрязнение окружающей среды антигололёдными реагентами вызывает повышение солености в водных экосистемах во многих регионах мира [1]. Наиболее популярными средствами для борьбы со льдом на дорогах являются хлористые соли [2-4]. Использование таких средств приводит к поступлению катионов (Na+, Ca2+ и т.д.) и хлорид- аниона (Cl-) в поверхностные и подземные водоёмы и водотоки прилегающих территорий [2, 5]. Известно, что функционирование водных экосистем в значительной степени зависит от солёности воды, поскольку это один из ключевых факторов, определяющих видовой состав, структуру трофических сетей и продуктивность сообществ в водоёмах [5, 6]. В последние годы опубликовано значительное количество работ, рассматривающих регулярное и долговременное применение солесодержащих смесей как причину постепенного химического загрязнения водных экосистем [1-4, 7, 8]. В Северной Америке и Европе применение соли для удаления наледи на автомобильных дорогах, практикуемое уже более 50 лет [3], признано одним из основных источников хлоридов в подземных водах, ручьях, реках и озёрах [9].
Во многих городах Российской Федерации в последние годы резко возросла интенсивность применения солесодержащих смесей для борьбы с обледенением дорожных покрытий и пешеходных зон [10]. Использование таких смесей вызывает обеспокоенность общественности и привлекает внимание контролирующих органов. Для прогноза последствий возможного химического загрязнения водных и наземных экосистем в результате долговременного применения солесодержащих смесей необходимо иметь представление о пределах устойчивости организмов, населяющих пресноводные объекты и почвенные системы, к компонентам, входящим в их состав [11]. На территории России исследования, устанавливающие такие пределы, немногочисленны и представлены преимущественно работами по изучению влияния противогололёдных средств на микробиоту почвенного покрова вдоль дорожных полотен и высшие растения [12, 13].
Цель данной работы - определить пороговые концентрации растворов противогололёдной солевой смеси «Бионорд», содержащей в своем составе хлориды натрия и кальция, при которых наблюдаются негативные эффекты на параметры развития животных и растительных тест-объектов.
Материалы и методики исследования
Для оценки пороговых концентраций растворов противогололёдной солевой смеси использованы стандартный для экологического мониторинга луковый тест (Allium-тест) на основе лука репчатого Allium cepa L. (Liliopsida: Amaryllidaceae) [14-17], а также острый и хронический тесты с пресноводным рачком Moina macrocopa (Straus, 1820) (Cladocera: Moinidae) [18, 19].
Во всех экспериментах в качестве модельного антигололёдного средства протестирована солесодержащая смесь «Бионорд» [20, 21]. Тестируемые растворы готовили путем разведения исходного стокового раствора с концентрацией смеси 200 г/л. Элементный состав всех тестируемых растворов и контрольной среды определяли с помощью ИСП-спектрометра iCAP 6300 Duo («Thermo Scientific», Великобритания) [18], удельную электропроводность - с помощью кондуктометра STARTER ST300C («Ohaus Corporation», США), водородный показатель - с помощью pH-метра PB-11 («Sartorius», Германия). Калибровка приборов проводилась перед каждой серией измерений. Измерения выполнены в аналитической лаборатории Института биофизики СО РАН (г. Красноярск).
Физико-химическая характеристика растворов антигололёдной смеси. На основании химического анализа выделены элементы, концентрация которых в воде линейно зависела от концентрации растворенной смеси (коэффициент детерминации R2 от 0,99 до 0,60). Сумма этих элементов составляла 85,0% от количества растворенной смеси (Cl: 48,0±5,8%; Na: 28,7±2,1%; Ca: 7,9±0,5%; S: 0,2±0,1%; K: 0,20±0,01%; Mg: 0,01±0,01%; Sr: 0,006±0,001%; B, Ba, Cr, Cu, Ga, Li, Mn, Mo, V в сумме: 0,003%). Концентрации Al, As, Bi, Cd, Co, Fe, Ni, P, Pb, Sb, Se, Sn, Ti, Zn слабо зависели от концентрации смеси в растворе (R2 от 0,5 до 0,003). Доля неучтенных при анализе растворов элементов в массе смеси не превышала 15%.
Доля нерастворимой минеральной фракции в массе смеси составила 1,18±0,15% (n = 4). Для её определения раствор смеси центрифугировали в течение 30 мин при 8 000 g, 20 °C. После первичного центрифугирования осадок трижды промывали дистиллированной водой и центрифугировали, затем высушивали при температуре 105 °C и взвешивали на аналитических весах.
Зависимость удельной электропроводности раствора (у) от концентрации растворенной смеси (х) описывается линейным уравнением y = 1,22x+1,57 (R2 = 0,99). Величина pH растворов не зависела от концентрации смеси, в острых и хронических тестах на ветвистоусых ракообразных составляла 7,7±0,2, в тестах на луке репчатом - 7,0±0,7.
Allium-тест. Для экспериментов использовали головки лука репчатого сорта Штуттгартер Ризен диаметром 1,8±0,1 см, массой 2,27±0,17 г. Перед экспериментом луковицы вынимали из холодильника, где они хранились при температуре 5 °С в течение двух недель, далее вымачивали несколько часов в дистиллированной воде и после удаляли отмершие поверхностные ткани. Подготовленные луковицы помещали на 48 ч корневой частью в пробирки, содержащие по 20 мл растворов смеси в различной концентрации или водопроводной воды. Для каждой концентрации смеси и в контроле протестировано по три луковицы. Проведено два последовательных эксперимента, в каждом из которых протестировали растворы со следующими концентрациями смеси в дистиллированной воде: 1,0; 2,5; 5,0; 7,0; 10,0; 15,0; 20,0; 50,0 г/л.
Для оценки общей токсичности измеряли длину корней и рассчитывали среднюю и суммарную длину корней на каждой луковице (см). Для оценки цитотоксичности рассчитывали митотический индекс (МИ) - отношение числа делящихся клеток в апикальной меристеме корней к общему числу клеток. Для подсчета МИ для каждой концентрации реагента отбирали по пять корешков лука длиной 0,8-1,4 см случайным образом из корней, выросших на трех луковицах. Корешки фиксировали, красили 2% раствором ацетоорсеина и готовили из них препараты по ранее описанной методике [14]. Препараты просматривали под микроскопом (*400). В каждом препарате просматривали такое количество полей, чтобы набрать в сумме около тысячи интерфазных и делящихся клеток. МИ рассчитывали как долю делящихся клеток, находящихся в стадиях профазы, метафазы, анафазы и телофазы, к сумме делящихся и интерфазных клеток и выражали в процентах.
Острые и хронические тесты с рачками. В работе тестировали лабораторную культуру M. macrocopa, полученную из покоящихся яиц. Культура рачков вместе с грунтом предоставлена В.К. Чугуновым из временного пересыхающего пруда в окрестностях Института биологии внутренних вод РАН (пос. Борок, Ярославская область).
Для всех экспериментов тестируемых ювенильных самок получали от материнских особей, которых культивировали индивидуально в благоприятных для партеногенетического размножения условиях (температура 26 °C; фотопериод 16 ч свет : 8 ч темнота; концентрация пищи 200*103 кл./мл; объем среды 20 мл) [18, 19]. В острых и хроническом экспериментах самок в первые сутки их жизни (размер тела 0,5-0,6 мм) рассаживали по одной в стаканчики с отстоянной (не менее 72 ч) водопроводной водой (20 мл) с добавкой смеси в определенной концентрации. Контроль - группа животных в водопроводной воде. Стаканчики с животными во время острых и хронического экспериментов находились в контролируемых условиях (температура 26 °C; фотопериод 16 ч свет : 8 ч темнота). Для каждой концентрации смеси в растворе и контроля протестировано по 20 животных в острых и по 15 животных в хроническом экспериментах.