С целью изучения разнообразия физиологических групп микроорганизмов, контролирующих трансформацию костных останков в природе, труп экспериментального животного сначала помещали в природные условия на специально оборудованную площадку для развития гнилостных явлений. Затем кости изымали из естественной среды и в лабораторных условиях помещали в нестерильную, увлажненную огородную почву для создания эффекта «почвенной ловушки» для микроорганизмов, участвующих в разложении костной ткани. Модельные опыты проведены при разных температурных условиях: +37°С, +21°С и +5°С. Общая продолжительность эксперимента составила 14 месяцев.
Микрофлору с фрагментов костей отбирали методом смывов с помощью стерильных тампонов. Для получения статистически достоверных результатов смывы с пробной поверхности отбирали рандомно от трех до пяти образцов. Микробиологический анализ проводили сразу после отбора образцов. Для этого пробы суспензировали в физиологическом растворе и в объеме 0,1 мл инокулировали в элективные питательные среды, предназначенные для развития узкой группы микроорганизмов, выполняющих определенную функцию в процессе диагенеза.
Для преимущественного выделения из смывов с поверхности костей спорообразующих аммонифицирующих бактерий предварительно проводили пастеризацию отобранных смывов, при этом вегетативные клетки погибали, сохранялись только спорогенные бактерии. С учетом принадлежности выделяемых микробов к мезофилам накопительные культуры получали при комнатной температуре в диапазоне от 24±3°С до 37±1°С. Учет количества представителей определенной физиологической группы проводили методом предельных разведений с использованием таблицы Мак-Креди.
На базе ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» лаборатории молекулярной диагностики ЦКП «Биоинженерия» (Москва) выполнено генотипирование шести культур микроорганизмов с неясным таксономическим положением. Для этого выделены препараты ДНК, получены ПЦР-фрагменты генов, кодирующих 16S рРНК, проведено секвенирование этих фрагментов, осуществлена оценка степени чистоты культур. Проведен BLAST-поиск по международной базе данных GenBank, с помощью онлайн-сервиса RDP-Classifier определена таксономическая принадлежность исследованных бактерий.
Для изучения направленности процессов биогенной деструкции костного коллагена проведена серия модельных экспериментов по выделению в чистую культуру коллагеназпродуцирующих микроорганизмов рода Bacillus и рода Clostridium. Культивирование продуцентов коллагеназ выполняли с увеличением диапазона температур от +20оС до +50°С в суховоздушном охлаждающем термостате ТСО-1/80 СПУ. Идентификацию выделенных бактерий до вида выполняли согласно критериям «Определителя бактерий Берги» [9]. Для анализа коллагеназной активности бацилл и клостридий использовали модифицированный метод агаровых блоков Н.С. Егорова [14]. Питательную среду для визуализации ферментативной активности микроорганизмов готовили по Q. Wu с соавт. [15] в авторской модификации.
Заключение
Использование предложенного алгоритма изучения процессов разложения трупа, опосредованного деятельностью микроорганизмов, позволяет подробно проанализировать основные закономерности разложения трупов различных по размеру и массе экспериментальных животных на протяжении длительных отрезков времени, изучить микробиом трупов и эпинекротическое микробное сообщество, применить традиционные (бактериологические и бактериоскопические) и современные (молекулярно-генетические) методы исследования.
Результаты подобных исследований могут быть использованы в судебно-медицинской экспертизе для решения остро стоящих экспертных проблем, в частности для определения давности наступления смерти в поздний постмортальный период и выявления микробиологического патоморфоза посттравматических изменений.
Список литературы
1. Маслова Е.Н., Болдырева О.В. Значение посмертной микробиологической диагностики в судебно-медицинской практике. Материалы VI Всероссийского съезда судебных медиков. М.-Тюмень, 2005. С. 195.
2. Середкина M.A., Кречикова О.И., Сухорукова М.В. Микробиологическое исследование аутопсийного материала и интерпретация его результатов // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000. №. 2(2). С. 79-85.
3. Приходько А.Н., Лаврукова О.С., Лябзина С.Н., Сидорова Н.А., Попов В.Л. Использование микробно-энтомологических данных для установления давности наступления смерти // Судебно-медицинская экспертиза. 2018. № 6(61). С. 52-57.
4. Melvin J., Cronholm L., Simson L., Isaacs A. Bacterial transmigration as an indicator of time of death. Journal of Forensic Sciences. 1984. V. 29. Р. 412-417.
5. Metcalf J.L., Wegener Parfrey L., Gonzalez A., Lauber C.L., Knights D., Ackermann G., Humphrey G.C., Gebert M.J., Van Treuren W., Berg-Lyons D., Keepers K., Guo Y., Bullard J., Fierer N., Carter D.O., Knight R. A microbial clock provides an accurate estimate of the postmortem interval in a mouse model system. eLIFE 2. 2013. Р. e01104.
6. Pechal J.L., Crippen T.L., Benbow M.L., Tarone A.M., Dowd S., Tomberlin J.K. The potential use of bacterial community succession in forensics as described by high throughput metagenomic sequencing. International Journal of Legal Medicine. 2013. V. 8. Р. 240-242.
7. Hyde E.R., Haarmann D.P., Lynne A.M., Bucheli S.R., Petrosino J.F. The Living Dead: Bacterial Community Structure of a Cadaver at the Onset and End of the Bloat Stage of Decomposition. PLOS ONE. 2013;8(10): e77733.
8. Johnson H.R., Trinidad D.D., Guzman S., Khan Z., Parziale J.V., DeBruyn J.M., Lents N.H. A machine learning approach for using the postmortem skin microbiome to estimate the postmortem interval. PLOS ONE. 2016. V. 11(12). Р. e0167370.
9. Определитель бактерий Берги / Под ред. Дж. Хоулта. М.: Мир, 1997. 429 с.
10. Лаврукова О.С., Лябзина С.Н., Приходько А.Н. Метод изучения некрофильных насекомых на трупах крупных животных // Принципы экологии. 2016. № 2. Р. 91-98.
11. Лаврукова О.С., Лябзина С.Н., Сидорова Н.А., Приходько А.Н. Энтомологические и микробиологические особенности разложения трупов, подвергшихся воздействию пламени //Вестник судебной медицины. 2018. № 7(4). Р. 30-35.
12. Лаврукова О.С., Лябзина С.Н., Приходько А.Н., Сидорова Н.А. Каталогизация микроорганизмов в составе микробиома трупа // Journal of Biomedical Technologies. 2016. № 1. С. 24-34.
13. Сидорова Н.А., Попов В.Л., Лаврукова О.С., Лябзина С.Н., Приходько А.Н. Специфика путрификации трупа под действием ферментных систем некробиома // Судебномедицинская экспертиза. 2017. Т. 60(5). С. 18-22.
14. Егоров Н.С. Метод диффузии протеолитических ферментов из блоков агара с культурами микроорганизмов. М.: Наука, 1971. 18 с.
15. Wu Q., Li C., Chen H., Shuliang L. Purification and Characterizationof a Novel Collagenase from Bacillus pumilus Col-J. Applied Biochemistry and Biotechnology. 2010. V. 160. Р 129-139.